利福布汀PCR在临床的 应用

2021年1月30日发(作者：乳腺癌的治疗方法)
PCR
在临床上的应用

在临床、血液筛查中应用：


自
2002
年初国家下达有关文件正式对
PCR
技术用于临床检验解 禁以来，
此项技术就在全国多家医院如
火如荼地推广开。荧光
PCR
技术在原 理上对传统
PCR
技术大大改进，不仅拥有普通
PCR
的所有优点，还提高了特异性和敏感度，定量更为准确可靠，尤其是闭管、双检、防污染等特点，使得它已具有挑战、更新、< br>替代传统
PCR
技术的趋势。
迄今，
深圳匹基公司已经研究开发出二十 多种荧光
PCR
试剂盒，
其中
HBV
、
HCV
、< br>HIV
、
NG&CT
、
TB
等产品已获得国家生产批号，且均 通过北京、上海等地知名大医院的严格临床考核，与国
际上公认的同类产品相比结果表明已接近或达到国 际水平。正式大规模投产后，已在全国多家医院、科研
院所、卫生部门、血液制品厂、各地血站等单位推 广使用，具体应用于临床早期诊断、药物疗效观察、预
后判断、流行病学调查、血液筛查、输血安全性判 断等方面。

植物检验检疫：


植物检疫检疫主要是对现场 检疫取回的植物实体和病、虫、杂草籽样本于实验室做进一步检验鉴定。
技术和方法因病、虫、杂草、植 物或其产品种类的不同而有很大差别。在检疫肉眼不可见的生物（除昆虫、
杂草外的绝大多数需检的有害 生物）中，经典方法如细胞培养、形态观察及生理生化分类等十分耗时、耗
财而且有较大的病原体扩散风 险及对操作人员构成安全隐患。而分子生物学检测方法中核酸杂交技术虽灵
敏，但操作过于复杂，重复性 不好又需引入放射性同位素因而不适于推广。基于单克隆抗体的免疫学方法
（如酶联免疫吸附法
ELISA
）灵敏度虽也得到提高，但始终不及荧光
PCR
方法，并且特异性及样品的 适用
范围（植物物种及部位来源）也不如后者。目前进、出境或双边检疫协定所要求检疫的植物病害项目 中植
物病毒、病原性细菌、病原性真菌及植物线虫均有十几、二十几种，几乎所有的项目都可以开发出相 应的
有针对的荧光
PCR
试剂盒，不仅可大大提高植物检验检疫水平，更重要的是争取 宝贵时间，有力控制植物
病虫害的横、纵向蔓延。

动物检验检疫：


动物及其衍生产品与人的生活尤为密切相关，
根据不完全统计，
仅是 人畜共患的传染病业已达
196
种，
所以动物检验检疫工作更不容忽视，
它对 保护公民生命安全具有非常重要的现实意义。
比如疯牛病
（
BSE
）
、
禽流感
（
AIV
）
就是因为与人的健康相关而引起世界范围内的广 泛关注。
目前采用的检测技术主要分为几类：
病原体分离培养技术、检测蛋白的免疫学技术、检 测特殊蛋白功能的生物学方法（如抗生素、抗除草剂等
实验）、核酸（
RNA
或
DNA
）检测技术。与检测核酸的
PCR
技术相比，其它方法的灵敏度、特异性及精 确度
都明显不及，而且时耗又很长（通常三周至月余），越来越不适应动物活体或有保质期严格要求的动 物加
工食品快速准确地判断检疫与通关的需要。对
PCR
产物特异片段确认方法，有如 电泳、
RFLP
、序列分析，
仅当检测鉴定少数样品、少数特殊种类时还可负担起相应 的工作量和财力。但对于进出境口岸产品检测样
品数量大，种类多的特点，更需要一种便于机械化自动化 、更特异、更灵敏、无污染、成本又相对低廉的
PCR
产物检测方法，而荧光
PCR< br>技术的出现完全可以满足以上需要，是最有前途的新型方法，可用于对输
出国或地区、出入境口岸 地区与出入境动物内地饲养所在地区动物及其加工产品中传染病病源的监测。目
前，深圳匹基公司利用此 项先进技术，已开发出
AIV
各亚型（主要是
H5
、
H7
和
H9
）及通用型的荧光
PCR
检测试剂盒，完成了养殖场现场的区域实验，并 通过专家严格认证，此外我们还正积极开发针对于其它目
前迫切需要的国际兽疫局
（
O IE
）
所规定的一类传染病及寄生虫病病原体检测用的试剂盒（如疯牛病朊病毒
（BSE
）、新城疫病毒（
NDV
）、猪瘟病毒（
CSFV
）、口 蹄疫（
foot-and-mouth disease virus
）等）。


我国最近几年来，部分地区陆续发生严重的禽流感病毒的感染，在鸡、鸭群中广为流行 ，造成严重的
经济损失，对禽肉出口创汇构成巨大的威胁。特别是香港特别行政区还发生人的感染，造成 人心煌煌，带
来更深的社会危害。促进对外贸易的顺利发展。此外，荧光
PCR
方法快 速诊断方法的建立，也有利于及时
采取有效措施，控制生产场疫情的进一步蔓延，将经济损失降到最低。

食品、饲料卫生：


动物饲料、饵料及人类食品的质量卫 生要求有多项与生物学相关的规定，如用作加工生产的动物原材
料必需持有非疫区证明书和产地检疫证明 书（适用于所有生物病原体造成的病例）；许多食品生产规定了
单位体积或单位重量细菌形成单位的上限 ，大肠杆菌不得超标，
肠道致病菌
(
沙门氏菌及志贺氏菌
)
、其他
致病性菌（如金黄色葡萄球、溶血性链球菌）与动物寄生虫等有害生物不得检出；罐头食品、矿 泉水甚至
要求商业无菌；有些出口产品还需应相应国家的要求检测葡萄球菌毒素、大肠杆菌肠毒素、贝毒 素等。传
统的细胞培养及生化鉴定法耗时长，不利限时通关，且灵敏度还有待提高，特别是对低含量却高 毒性、高
爆发性、不易培养成功的某些病毒来说（特别是导致人畜共患病或
/
和对畜牧 业、禽业、水产养殖业危害极
大的
OIE
规定的一类传染病病源体），更急需建立快速 、灵敏、高效、适应性广的检测监控方法。在目前
形形色色的方法中，荧光
PCR
技术 最能满足这些苛刻的要求。另外，荧光
PCR
技术也能方便地检测出待测
菌种、物种有 毒基因的存在与否，所以对各种毒素的监测也能胜任。

化妆品工业：


同食品一样，化妆品生产也有其卫生指标：细菌总数（不同产品标准都不同，另还与使用对象年龄有关）；粪大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌必须阴性等。有些化妆品的原材料是动源性的，如羊胎素、牛乳，动物表皮生长因子、透明质酸、水解角蛋白等因有污染人畜共患病致病因素的可能，如从欧洲进口的高级化妆品按我国检疫部门规定必须检查疯牛病朊病毒一项，故必须接受安全检查。以上几类皆属荧光
PCR
技术的应用范畴。

转基因作物（
Genetically
Modification
Organisms,
GMOs
）与转基因微生物（
Genetically
Modification
Micro-Organisms, GMMs
）的检测：

GMOs
和
GMMs
是指遗 传物质被改造的生物实体和微生物体。这些生物体遗传物质的改造不是通过杂交
或自然发生的遗传因子配 对或重组实现，而是通过
DNA
重组技术或遗传工程的方法将一种生物体或一个物
种的 基因转移到另一种生物体或另一种物种中。根据国际农业生物技术应用咨询服务中心（
ISAAA
）统计，
2001
年全世界已试种的转基因植物已超过
4500
种，
其中已批准商业化种植的已近
90
种，
种植面积为
5260
万公顷 ，遍布十多个国家，其中
99
％的转基因作物种植于美国、阿根廷、加拿大和我国，已批准商品 化转
基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛 、亚
麻、烟草、西瓜、菊苣等。据估计，用这些转基因作物生产的加工食品有近万种。转基因技术在生物 制药、
疫苗及工业用酶生产领域虽已成为常规技术，
但由于转基因食品对人和动物的健康及生态 环境有很大影响，
故一直受到世界各国及联合国等国际组织的关注。


由于各国利益不一致，对转基因生物检测国际上目前尚无统一的方法和标准。国外现主要采用两类方
法 ，即检测蛋白质的免疫学方法（主要是
ELISA
方法）和检测核酸（
RNA
或
DNA
）的
PCR
方法。
PCR
产物最
早检测方 式为琼脂糖凝胶电泳，传统杂交或测序，为了提高检测效率，又出现了
PCR
－
ELI SA
，最后发展成
更加快速、准确、灵敏、可靠的实时荧光
PCR
方法并用于 定量。检测对象不同，决定了两类方法的优缺点
各有不同，并导致了适用范围的差别。
ELIS A
方法需要制备不同种类的特异性抗体来针对蛋白作检测，但
蛋白的表达受作物品种、部位、加 工程度等因素影响，而且只可相对定量。而荧光
PCR
检测核酸灵敏度和
精确度很高， 定量也可靠的多，但受样品类型（物种基因组大小）及加工程度的影响较大，特别是对核酸
已遭受很大破 坏的深加工产品检测难度更大。目前国外已开始了正式的检测工作，我国的检测出证工作也
正启动，针对 转基因作物的数目和复杂性不断增长的现状，建议以上两种方法协同使用，优势互补，除了
查找食物中是 否混有一定比例的转基因物质外，还可对整个作物加工过程进行全程追踪。






PCR
技术应用进展






PCR
技术自
1985
年建立以来，发展 之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力
.
近些
年来，基于
PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对
PCR
技术进行研究和改进，使
P CR
技术
得到了进上步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途
.
原位
PCR
技术



原位
PCR
就是在组织细胞里进行
PCR
反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感< br>的
PCR
技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术
.


原位
PCR
是
Hasse
等于
1990
年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细
胞等
.
其基本方法为①固定组织或细胞
:
将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并 用多聚甲醛
处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.②蛋白酶
K
消化处理
:
用
60ug/ml
的蛋白酶
K
将固定好的组织
细胞片
55℃消化处理
2h
后，96℃2min
以灭活蛋白酶
K.③PCR
扩增
:
在组织细胞片上，加
PCR
反应液，覆
盖并加液体石蜡后， 直接放在扩增仪的金属板上，进行
PCR
循环扩增
.
有的基因扩增仪带有专门 用于原位
PCR
的装置.④杂交
:PCR
扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针 进行原位杂交.⑤显微镜观察结果
.


原位
PCR
既能 分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上
研究疾病的发病机理 和临床过程及病理的转归有重大的实用价值
.
其特异性和敏感性高于一般的
PCR.
连接酶链反应



连接酶链反应
(Ligase chain reaction
，
LCR)
，是一种新的
DNA
体外 扩增和检测技术，主要用于点
突变的研究及靶基因的扩增
.



连接酶链反应是
Backman1997
年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明， 并申报了专利
.1988
年
Landegren
也进行了该项研究
. 1988
年
Backman
等又因分离热稳定的连接酶，
而申报专利，
1991
年
Backman
和
Barany
分别用耐热
D NA
连接酶进行了
LCR
试验
.
耐热
DNA
连接酶 可以在热循环中保持活性，提高连接
反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序.


LCR
的基本原理为利用
DNA
连接酶
.
特异地将双链
DNA
片段连接，
经变性
-
退火
-
连接三步骤反复循环，
从而使靶基因序列大量扩增
.
其程序为
:< br>在模
DNA
、
DNA
连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首
先加热至一定温度下
(94
～95℃)使
DNA
变性，
双链 打开，
然后降温退火(65℃)，
引物与之互补的模板
DNA
结合并留下一缺 口，
如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，
DNA
连接酶即可连 接封
闭这一缺口，则
LCR
反应的三步骤
(
变性
-
退火
-
连接
)
就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮
反应 中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增
.
若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精 确结
合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物
.


LCR
的引物是两对分别互补的引物，
引物长度为
20
～
26
个，
以保证引物与靶序列的特异性结合，
LCR
识别 点突变的特异性高于
PCR
，
其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，
其次是耐热连接酶的特异
性
.LCR
连接反应温度接近寡苷酸的解链温度
(T m)
，因而识别单核苷酸错配的特异性极高
.


LCR
的扩增效率与
PCR
相当，
用耐热连接酶做
LCR
只用两个温度循环 ，
94℃min
变性和
65℃复性并连
接，循环
30
次左右
.
其产物的检测也较方便灵敏
.
目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生 物病原体
的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型 鉴定，
癌基因的点突变研究等
.


依赖核酸序列的扩增