蓖麻油的作用乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

2021年1月29日发(作者：慢性酒精中毒的治疗)







毕

业

论

文

题




目：乙肝表面抗原的
ELISA
法定量分析方法学验证











姓




名：







































学




号：





































专




业：











































指导教师：














































教师职称：




































研究起止日期：











































研究提交日期：

























































































二

○一

三

年


十一

月






目

录



中文摘要
........ .................................................. ......................................1
英文摘要................................................ ................................................1
前言
........................................ .................................................. ..............2
1.
材料与方法
............... .................................................. ........................3
1.1
试剂盒
...... .................................................. ................................3
1.2
仪器
................................................. ............................................3



1.3
方法
....................... .................................................. ....................3
1.3.1
溶液配制
...... .................................................. ...................4






1.3.2
铺板方案
............................ ...............................................4
1.3.3
加样步骤
......................... .................................................. 5
2.
结果
............................... .................................................. ...................6





2.1
标准曲线与线性范
.......................... ........................................6




2.2
准确度（回收率）的验证
........ ..............................................6




2.3
精密度的验证
........ .................................................. ................7







2.3.1
板内精密度的验证
................... ......................................7







2.3.2
板间精密度的验证
................................................. ........8




2.4
检测限（
LOD
）计算
.................................... .........................10
3.
讨论
..... .................................................. ............................................10




3.1
乙肝表面抗原定量分析的意义
. ............................................10




3.2
常用定量分析方法
...... .................................................. .........11





3.3
方 法概述
........................................... .....................................11




3.4
方法学验证内容
................. .................................................. .12




3.5
结果分析及应用评价
. .................................................. ..........13
参考文献
......................... .................................................. .....................14
综述
................ .................................................. ......................................15
致谢
................................................. .................................................. .....18










乙肝表面抗原的
ELISA
法定量分析方法学验证


中文摘要

目的
：
对福州蓝图生物工程有限公司生产的
HBsAg
的
ELISA
法定量
分析试剂盒进行方法学验证，
以判断是否能用于临床样本分析。
方法
：
ELISA
法定量分析，应用试剂盒
HBsAg
标准品从浓度为
8ng/m l
做
2
倍稀释的
6
个浓度梯度做标准曲线，以
6
，
3
，
1.5ng/ml 3
个浓度梯
度
5
复孔做准 确度，精密度和检测限等方法学验证。
结果：
标准曲线
R2=0.997
，< br>准确度
97.07%
，
1.5ng/ml
的
RSD
为
16.78%
，
不满足
ng/ml
级水平的
RSD
一般应
<15%
的要求，检测限
LOD
为
0.172ng/ml，

低浓度样品
（
<1.5ng/ml
）
的检测在准确 性和精密度方面都低于高浓度
样品，不适合低浓度样品的检测
。
结论：
该HBsAg
的
ELISA
法定量
分析试剂盒不能用于临床标本的分析。< br>
关键词：
乙肝表面抗原


ELISA


定量分析


方法学验证














The reification of the
HBsAg ELISA quantitativmethodology
Abstract In English
Object:

Fuzhou
blueprint
biological
engineering
company
to
make
sure
whether it ca be used to the analysis of Clinical

Methods:

Key words:




乙肝表面抗原的
ELISA
法定量分析方法学验证

前

言

乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，
而乙型肝炎血清
标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。
随着免疫学技术的不
断发展，
抗原抗体 检测灵敏度明显提高，
使低水平乙肝病毒得以检出，
对临床诊断及流行病学有重要意义
[1]
。
ELISA
法具有较高灵敏度、
特
异性强、重复性好、可进 行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫
分析仪上做批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分 析，
若想知道检
验结果是否可靠，
实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，
本实
验对福州蓝图生物工程有限公司生产的
HBsAg
的
ELISA
法定量分析
试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。


1.

材料与方法


1.1
试剂盒



乙肝表面抗原
ELISA
法定量分析试剂盒，
福州蓝图 生物工程有限
公司出品。


1.2

仪器


酶标仪：
Bio-Rad 680
；洗板机：
Bio-Rad 1575
；超纯水系统：
Millipore Elix
；电热恒温培养箱
(DNP-9052)
上海精宏实验设备有限
公司；振荡器（苏州管械，
KJ-201 A
）
；移液器；
Tip
头；
EP
管。


1.3

方法




1.3.1
．溶液配置





1
×
PBS
缓冲液的配置：

称取
8g NaCl
、

0.2g KCl
、
1.44g
Na2HPO4
和
0.24g KH2PO4
，溶于
800ml蒸馏水中，用
HCl
调节溶液的
pH
值至
7.4
，最后 加蒸馏水定容至
1L
即可。

标准品的配置：原始标准品浓度为
8 ng/ml
。
。取
6
个
2mlEP
管，分
别标记为
S1-S6
。
50ul/well,
共
1
孔需
5 0ul
，每孔配置
60ul
备用，按照下
表稀释方案进行稀释。





















表
1

标准品的稀释方案







编号

S1
S2
S3
S4
S5
S6
终浓度

预加
1
×
（

ng/ml
）

PBS
8
0
60
4
60
2
60
1
60
0.5
60
0.25
取

标记

（
ul
）

标准品

120
S1
60
S2
60
S3
60
S4
60
S5
60
剩余
（
ul
）


60
60
60
60
60
质控品的配置：
50ul/well,
共
5
复孔需
250ul
，
配置
300ul
备用，
取
3
个
2mlEP
管，分别标记为
C1
，
C2
，
C3
，按照下表稀释方案进行稀释。



















表
2

质控品的稀释方案


编号

C1
C2
C3
终浓度

预加
1
×
（

ng/ml
）

PBS
6
150
300
3
300
1.5
取

标记

（
ul
）

标准品

450
300
C1
300
C2
剩余
（
ul
）


300
300
1.3.2
．铺板方案



取出试剂盒中已包被酶标板，
取出板条，
按照下表铺板方案进行
铺 板在相应孔中依次加入系列标准品、
质控品及空白对照，
每孔
50ul
。

空白对照加入
1
×
PBS
缓冲液。




















表
3

铺板方案





A
B
C
D
E
F
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
2
C1
C1
C1
C1
C1
C2
3
C2
C2
C2
C2
C3
C3
4
C3
C3
C3
PBS
PBS
PBS
5
PBS
PBS










1.3.3
．加样步骤


加入酶标抗体，
50 ul/well
，
震荡。
37
℃电热 恒温培养箱温育
60min
，
取出后洗板
4
次，

加入
A
、
B
液
, 50 ul/ well
，
37
℃电热恒温培养箱温育
15 min
。加入终止液，
50 ul/ well
。酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在
电脑上打开
Microplate Manager 5.2
软件，选择
450nm
波长（参照波长
630nm< br>）
，设置
LAYOUT
和报告模式，测定各孔吸收值。


2.

结果


2.1
标准曲线与线性范围


标准品理论浓度对应的实测
OD
值

















表
4

实测
OD
值

HBsAg(ng/ml)
OD


8

4

2

1

0.5

0.25

以
HBsAg
理论浓度为 横坐标，所测
OD
值为纵坐标作图，绘制标
准曲线观察线性关系，结果显示
R 2=0.9973
，显示具有良好的相关性



2.0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
(
O
D
)
1.5
1.0
0.5
0.0
0y = 0.1816X + 0.2307
R
2
= 0.9973< br>1
2
3
4
5
6
7
8
9




Conc(ng/ml)






















图
1

线性关系图


2.2
准确度（回收率）的验证



质控品理论稀释浓度对应实测浓度值
















表
5

实测浓度值

HBsAg
(ng/ml)
6
3
1.5

1



2



测定值

3



4



5



质控品做了
3
个浓度梯度，
每个浓度做了
5< br>个复孔，
下表是对每个
浓度梯度进行准确度（回收率）的验证。
















表
6


准确度的验证

HBsAg
(ng/ml)


6





测定值（
ng/ml
）

回收率（
%
）

平均回收率

RR
（
%
）



97.58
















3
个浓度的
平
均
回
收
率









3


1.5
















113.07



80.56
97.07%





结果显示
HBsAg 6ng/ml
和
3ng/ml< br>的平均回收率为
97.58%
，
113.07%
，满足限度要求在85%-115%
的范围内，而
HBsAg 1.5ng/ml
的平均回收率为< br>80.56%
，满足方法定量限在
80%-120%
的范围内。
3个浓度梯度的平均回收率为
97.7%
，显示准确性好。


2.3
精密度的验证


2.3.1
板内精密度的验证


























表
7

板内精密度的验证

HBsAg
测定值


(ng/ml)
X
?
S

1
2
3
4
5

6

3

1.5





















RSD(%)


上表中
RSD(%)
这一参数表示相对标准偏差，
也就是变异系数
CV
值，
HBsAg 6ng/ml
的
5
个复孔的变异系数
CV
值为
12.73%
，
显示孔间差
异较大，精密度不高，但是也符合
ng/ml
级
RSD
水平的一般应
<15%
的
要求，其中有 一孔浓度为
4.55
，与其它孔比较差异较大，可能是由于
操作引起例如加样不准。而
3ng/ml,
和
1.5ng/ml
的变异系数
CV
为3.5%
，
3.7%
，符合显示孔间重复性好，符合
ng/ml
级
RSD
水平的一般应
<15%