南宁皮肤专科医院实验三 杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用

2021年1月28日发(作者：绞股蓝的功效)
实验三

杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用

一、试验原理和目的

在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质 ，它通过生物合成、释放以及与
受体的结合，使得神经传导能正常进行。当神经接受到某一刺激时，冲动 传导到突触处，就由突触前
膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞
100-150
个，每个小囊胞含有乙酰胆碱
(ACh)
分
300-2000
个。< br>在突触后膜上约有乙酰胆碱分子
900
个就可产生局部膜电位的去极化，
致神经 传导正常进
行。多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆 碱酯酶
(AChE)
所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。因此，比较乙酰 胆碱酯酶的活力和
性质，可以作为测定神经递质的一个指标。

有机磷酸酯和氨基甲酸 酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致
神经传导的阻抑而引起昆虫中毒 死亡。研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。其活力测定
方法较多，发展较快，有测压和测< br>pH
法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。其中比色法中由于
应用的底物和显色剂 不同，又有不同的测定方法。本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代
胆碱一二硫双对硝基苯甲 酸法
(ASCh
一
DTNB
法
)
。

该法 是
Ellmanl961
年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱
(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下
水解为硫代胆碱及乙酸，
然后以二硫双对硝基苯甲酸
( DTNB)
为显色剂，
形成黄色产物，
在
412nm
处有最
大吸收峰。生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代
表< br>AChE
的活性。

本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆 碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀
虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。

二、仪器、试剂和材料

1.
仪器

721
型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。

2.
供试昆虫

5
或
6
龄的粘虫或家蝇成虫。

3.
试剂

(1) 1.5%
溶液生理盐水：称取
kcl 1.5g，加入
98.5ml
蒸馏水，置于
100ml
的容量瓶中。

(2)
2.0
×
10
M
谷胱甘肽（还原型）生理盐水溶液 ：称取谷胱甘肽（还原型）
0.030733g
，以
1.5%
的
1. 5%
溶液生理盐水定容于
50ml
的容量中。

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(3) 0.2M PH7.6
磷酸缓冲液：取
0.2M Na
2
HPO
4
溶液
435ml
和
0.2M NaH
2
PO
4
65ml
混匀后装在
500ml
的容量瓶中。即称取
15.579g Na< br>2
HPO
4
?
12H
2
O
和
1.0 1407g NaH
2
PO
4
?
2H
2
O
，加入蒸馏水定容至
500ml
。

(4)
DTNB-
磷 酸盐
-
乙醇液：称取
12.4mgDTNB
溶于
95%
乙醇 （
120ml
）中，加入
80ml
蒸馏水，再用
缓冲液定容至
250ml
。

(5)
0.8
х
10
硫代乙酰 胆碱（
Asch
）生理盐水溶液：取
Asch0.011567g
，用
1.5%
溶液生理盐水定
容至
50ml
。

(6)
配制适当浓度的辛硫磷和灭多威丙酮溶液。

(7)
考马斯亮蓝
G
－
250
法测定蛋白含量用试剂。

A
牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取
100mg
牛血清白蛋白，溶于
100mL
蒸馏水中，即为
1 000
μ
g
／
mL
的原液。

B
蛋白试 剂考马斯亮蓝
G-250
的配制：称取
100mg
考马斯亮蓝
G-2 50
，溶于
50mL 90
％乙醇中，
加入
85
％（
W
／
V
）的磷酸
100mL
，最后用蒸馏水定容到
1 000mL
。此溶液在常温下可放置一个月。

C
乙醇

D
磷酸（
85
％）

（
8
）供试农药： 灭多威原药（
1.0mg/mL
）、辛硫磷原药（
1.0 mg/mL
）

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三、操作步骤

1.
试虫处理方法

用待测之杀虫剂丙酮溶液以饲喂法或点滴法处理试虫，待表现出明显中 毒症状时，置于冰箱冷冻
贮存待用。正常组只用等量丙酮处理虫体，于处理组表现症状的同时，也移于冰 箱冷冻室贮存待用。

2.
酶液制备方法

取处理和正常试虫各< br>10
头，剪取试虫头壳（带少量胸部）
，加入
0.2M
PH7.6< br>的磷酸缓冲液于冰浴
中匀浆（先放入头壳，加入
1.0mlPbs
，匀浆，至无 碎片且为浑浊溶液为止，倒入离心管中，分三次共
加
3.0mlPbs
）
，定 容匀浆液至
4ml
，在冰箱中于
4000rpm
离心
15min，取上清液冷贮供试。

3.
酶活性测定方法

（
1
）标准曲线制作

取
6
支试管，
分别 加入
0.0
、
0.05
、
0.1
、
0.15
、
0.2
和
0.25ml10
M
还原型谷胱甘肽溶液，
用
0.2MpH
磷酸缓冲液补足到
0.4ml
，加入二硫双硝基苯甲酸（
DTNB
）
-
磷酸
-
乙醇液
3.6ml,
在412nm
处测定
OD
值。以谷胱甘肽浓度为横坐标，
OD
值为 纵坐标做图，的标准曲线，求回归方程。

（
2
）酶活性测定
取处理、对照酶源各
0.2ml
，加入
0.2mlPH7.6
的
Pbs
（磷酸缓冲液）
；再加入
0.8mmAsch0.06ml
；
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