阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的诊断指南(流式细胞术)

2021年1月27日发(作者：鲁琦)
流式细胞术诊断并监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症和相关疾病指南

背景
：阵 发性睡眠性血红蛋白尿症（
PNH
）是一种特殊的获得性克隆性造血干细胞疾病，
该疾 病是由于
PIGA
基因体细胞突变，导致连接细胞膜的
GPI
相关锚蛋白缺失 所致。流式细胞
术是检测
GPI
相关锚蛋白缺失的方法之一，同时也是诊断
P NH
所必需的检测指标。然而到目前
为止，对于运用流式细胞术检测
GPI
相 关锚蛋白缺失方法还没有标准化、规范化。

方法
：在本论文中，我们将提出一致方案 ，介绍运用流式细胞术检测
PNH
的规范程序。

结果
：我们通过临 床症状和对数据的分析、结果报告对病例提出综合意见。但分析中，主
要集中在对分析过程的重要性。本 文将区分常规分析（定义为：缺失细胞占
1
％或更多）和高
灵敏度的分析（缺失细胞仅 占小于
0.01
％的
PNH
细胞）。其中如何设计抗体组合和设门对这
两种分析都是非常重要的，本文将做详细介绍。我们将通过对白细胞和红细胞的检测，以及各
自的检测 优势来讨论并评估
PNH
患者人群。我们目前提供的步骤仍需要进一步完善，使其成为
高灵敏度的检测技术，包括需要明确：试剂浓度；
PNH
克隆细胞在正常人群的发生率（背景） ，
并讨论此技术的缺点，因为此缺陷将可能影响到结果解释。

结论
：本论文 可适用于对
PNH
感兴趣和刚开始建立检测
PNH
克隆细胞的实验室，使其建 立
一个比较完善的实验流程；也可用于已开展此检测项目，以提高其该实验室检测技术和报告水
平。

背景

阵发性睡眠性血红蛋白尿（
PNH
）是一种罕 见的造血干细胞疾病，该疾病自
19
世纪初即被
确认为一个具有独特临床症状的疾病（
1,2
）。

在疾病的发展过程中，
PNH
有三个显着的临 床
特点，但是这三个特点的个体差异很大（
3-5
）。首先，以补体介导的血管内溶血 为主要临床
表现，包括：吞咽困难，嗜睡，勃起功能障碍（
ED
），慢性肾功能衰竭， 肺动脉高压，贫血，
和血红蛋白尿。其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于具 有特殊部
位，如肝门（
Budd - Chiari
综合征），脾，肠系膜静脉。第三 ，有发展为骨髓造血功能衰竭
的潜在风险，所有患者当疾病发展到一定程度都有可能发生，也是疾病发展 的终末期，表现为
免疫介导的严重的再生障碍性贫血。

关于本病的一个估计发病率仅 为每百万个人每年新发病例
1.3
。虽然
PNH
很早就被归为获
得性 的溶血性贫血，但是它确实影响到所有的血细胞谱系，因此，被认为获得性的造血干细胞
疾病，其病理生 理机制为
X -
连锁的
PIGA
体细胞突变
,
导致部分或绝 对
GPI
相关锚蛋白缺失。

PNH
干细胞被认为是逃避了免疫介导 的破坏，而这种免疫介导会破坏正常的骨髓干细胞，从而
PNH
的干细胞成为细胞生成的主要来 源。

CD55
—
GPI
相关锚蛋白的一种（衰变加速因子），其作 用为防止
C3
转换酶在补体级连反
应中的形成并增加其不稳定性；
CD59< br>（反应性溶血膜抑制物），抑制膜攻击补体复合物的形成，
CD55,CD59
共同反映 了
PNH
患者的红细胞对补体的敏感性。因此无论发生急性血管内溶血或是
慢性血管内 溶血，对于
PNH
患者来说，
CD55,CD59
缺失都是较典型的。
而在一些
PNH
病例，只
是
GPI
抗原部分缺失，这是因为有些类 型的
PIGA
突变，是可以合成一些
GPI
相关锚蛋白。

通过以上分析，了解了关于
PNH
的成因及病理学特点，及其与骨髓造血功能衰竭的关系，但是对导致骨髓造血功能衰竭及发生溶血的病理生理机制还不是很明确。尽管
PNH
是罕见 的，
但是合适的筛选和准确的诊断还是非常重要的，因为
PNH
的是一种慢性疾病，疾 病的长期存在，
对患者的生活质量及一些患者的生命将产生很大的影响。在过去几年中，对
P NH
治疗方案的
新发展（
9
）和一些成功的临床（
10
）试 验，已经极大地改善了患者的生活质量，使溶血性贫
血的患者溶血发生率降低，血栓形成风险减小，输血 要求减少（
10-13
），例如人造单克隆抗
体，它可以
抑制终
端的 补体
蛋白
C5
（
(Eculizumab;Alexion Pharmaceuticals, Cheshire,
CT)
。这使得
PNH< br>的筛查实验和准确的诊断成为临床实验室优先考虑重要工作。


国际
PNH
的兴趣小组（
I-PIG
）已经提出关于
PNH
的分类方案， 它包括三个主要类别，涵盖了
该疾病主要的临床表现谱（
14
）：（
1
）典型
PNH
，

有溶血和血栓形成倾向患者；（
2
）其 他
主要衰竭，如再生障碍性贫血或骨髓增生异常综合征
;
（
3
）亚临 床
PNH
患者，其中有少量
PNH
的克隆，但没有溶血或血栓形成的临床或实 验室证据。整个分类方案整体目的是提供一个共同
的国际术语。

PNH
诊断

由于
PNH
起初被认为是溶血性贫血的一种， 因此，最初
PNH
的检测主要集中检测红细胞相
关的实验：如
Ham
实验和蔗糖溶血实验。这两种检测手段都提示红细胞对补体介导的溶血敏感
度增加
(15
–
18)
。但二者都不是特异性检测，且操作不方便。补体敏感性溶血实验的特异性测
试，是通过检测不同浓度的补体造成不同程度的溶血来反映
;
实验表明，与正常细胞相比，< br>PNH
细胞在低浓度补体时就可溶解。（
19
）。这个测试也使人们认识到对于 某些
PNH
患者，与正常
红细胞（
I
型）和最异常的
PNH
型红细胞相比（
III
型）（
20,21
），仅有部分细胞对补体介 导
的溶血敏感（
II
型
），然而，而且这种检测比较费时，也难以标准化，可 能会漏诊较少量的
异常的
PNH
细胞（
22
）。

到目前为止，运用流式细胞术检测
GPI
相关锚蛋白的缺失已经成为诊断和监测
PNH
患者主
要手段。但是由于流式细胞检测技术的发展，对其所获得的数据分析是很复杂的，现代流 式技
术可以同时运用
5
种荧光素或抗体来标记样本，并且可以很快获取
1百万细胞，这种检测技术
的进步和其所获得的信息，可以避免少量
PNH
细胞的漏 诊，但遗憾的是对于数据所包含的信息，
临床还没能做到充分应用。

如何检测红细胞 和白细胞表面
GPI
相关锚蛋白的缺失，下面会详细描述，以往并没有强调
不同实验室 间需选用相同的单克隆抗体，其主要原因是由于有些单克隆抗体可以作用于多种不
同的
GPI< br>相关锚蛋白，它们都可以用来检测
PNH
克隆细胞。尤其对于很明显的
PNH< br>患者，
GPI
相关
锚蛋白缺失细胞很多。然而，一些室间质控数据表明，有些抗 体的质量比较差，

至少在检测
GPI
相关锚蛋白缺失的能力上可以体现。例 如，虽然
CD55
和
CD59
被广泛用于检测粒细胞上
PNH
克
隆细胞，有数据表明，它们也可能无法检测
PNH
的克隆细胞（
24-2 6
）。此外，这些试剂在检测
少量
PNH
克隆上的差别很大，在敏感度上的分 析能力上也较差。


越来越多的数据表明：检测白细胞
GPI
相关 锚蛋白缺失的最好的试剂含有荧光标记的气单胞菌
溶素
(aerolysin or FLAER; PinewoodScientific Services, Victoria, BC, Canada).
这是
一个与荧光素鳌
合形成的无
活性的细菌
变种 衍生物
，来自于通
道形成蛋白气
单胞菌溶素
(aerolysin)
，与其余试剂相比，在检测
PNH
克隆细胞上，
FLAER
的灵敏度很高，它 还可以与其
它单克隆试剂共同使用，检测
PNH
克隆细胞的
GPI
相 关锚蛋白和非
GPI
相关锚蛋白。


建立
PNH
免疫分型检测指南的必要性


为了有效管理< br>PNH
患者，
PNH
的正确诊断是非常重要的。但是，因为这种疾病较罕见，对 于
许多实验室，检测频率很低，因此，
PNH
检测方法差异性很大，（
22, 29-32
）。最近
EQA
数据提
示：实验室的数据已经提示漏诊了一些PNH
患者，或者在正常人群中也检测出
PNH
克隆细胞。

为了解决这些问题，
PNH
工作组在波特兰俄勒冈州举办了
2008
年临床流 式细胞仪协会年度
科学会议，在这次会议上，大多数参会者强烈要求发布关于
PNH
的 测试的准则，本论文将回应
这些要求。本论文通过收集资料，讨论，最终达成一致意见，形成以下观点。

针对
PNH
检测，各实验室已经建立了自己的检测方案，与本文相比，它们 所发表的数据明
显有局限性。到目前为止，还没有任何文献报道关于
PNH
一致的诊断 方案，本文作者所提出的
诊断方案是有病例依据的，并且同时也说明现存的某些检测方案和试剂与本文所 提的相比，明
显存在漏洞。有些方案并不能详尽解释结果，有些方案仅反映简单结果，而本文作者通过病 例
证明了本文所提出的方案是必需的也是最好的。我们希望本文方案能尽快得到进一步验证修订，
同时本文结尾也提到下一步修订需要考虑的问题，虽然检测方案的可变性很大，我们重点强调
此方案符 合最基本的诊断原则。

本文将分开阐述对于常规检测和高灵敏度检测的方案。常规检测即指可 以检测出
1%
的
PNH
细胞，这样有助于筛查具有溶血和出血倾向的
PNH
患者和再障患者的少量
PNH
克隆细胞，亚临床
PNH
患者。 常规检测方案相对简单，同时其他文献也有相关报道，因此检测准则也没有争议性，
其余实验室也很容易 按照原则执行。

而对于高灵敏度检测方案，在这里我们定义高敏度方案为可以检测出
0.01%
或者更小克隆
细胞，此方案将受到很大挑战，对于
PNH
患者及引 发相关功能失调患者，主治医生希望检验科
能用高敏度检测方案来监测这些患者
PNH
克隆变化，但是现有文献报道方案是远远不能满足此
要求，大家一致认为，高敏度检测方案较复杂，个体 差异很大，需要各环节特殊预处理，结果
分析报告也很复杂。

通过本文使各实验室建 立比较全面高敏度检测方案，提供更多的数据供该领域专家共同商
讨疑难问题解决方案，通过
P NH
检测准则的普及，提高
PNH
患者的生活质量。通过流式细胞术
数据所 提供的信息来监测
PNH
患者的自然疾病发展过程。


需进行
PNH
检测的临床症状和体征


由于
PN H
患者所表现的症状和体征较广泛，有一些体征是很常见的，考虑到它的发病率比
较低，因此， 对每一位有贫血和血栓形成倾向的病人做
PNH
检测筛查是不合理的，然而，有些
临床 症状也足以说明该患者必须进行
PNH
检测。

尽管仅有少数
PNH
患者会有血红蛋白尿，但是只要发现有血红蛋白尿的患者都需要进行
PNH
检测。抗体 介导的溶血性贫血为
Coombs
实验阳性患者，因此，
Coombs
实验阴 性患者必须作
PNH
检测，尤其是不存在细胞形态不正常的患者（球形红细胞，裂细胞或病态细 胞），或者无
明显感染造成溶血性贫血患者，
PNH
患者会伴随缺铁现象，是由于慢性 血管内溶血导致铁随尿
液丢失。

血栓形成较常见，约
40%PNH
患者有形成血栓的倾向，但是部位特殊，比如肝静脉，大脑沟，
异常的血栓表现；并且对于伴有血管内溶 血，全血细胞减少的血栓患者需要检测
PNH
细胞，约
10%
病人有腹痛和吞 咽困难，同样，如果没有排除其他疾病引起的以上症状，不建议进行
PNH
检
测。
典型
PNH
患者会有溶血现象，但是也有一些患者没有溶血现象，因此不能说没 有溶血现象
的病人就不需要检测
PNH
细胞。对于全血细胞减少患者进行
PN H
细胞检测争议比较大，当然如果
病例是青少年，全血细胞减少，有可能是再障，也有可能是由 于细胞发育障碍而引起，因此需
要检测
PNH
细胞。但是如果患者只有贫血表现，需要 将引起贫血的其他原因排除掉，还是不能
解释贫血原因，才需要检测
PNH
细胞。近期 ，
I-PIG
建议，凡是再障患者或是
MDS
（难治性全血
细胞减少 及多系发育异常）患者，都需要进行高灵敏度的
PNH
细胞检测，但是还没有规定它的
参考值及灵敏度。更有研究指出，其余类型的
MDS
患者或者骨髓增殖性疾病患者也应该列入筛
查范围。见表一

需进行
PNH
检测临床体征

有血红蛋白尿和血浆中血红蛋白升高体征的血管内溶血

不明原因溶血伴有下列情况

缺铁或

腹痛或食管曲张或

血栓形成倾向或

粒细胞减少和（或）血小板减少

Coombs
’试验阴性，非裂细胞症，非感染的溶血性贫血

非典型血栓形成特点如：

形成部位特殊

肝静脉（
Budd-Chiari syndrome
）

腹腔静脉（入口处，脾脏，内脏）

大脑沟

皮静脉

伴有如上症状的溶血性贫血

不明原因血细胞减少

骨髓衰竭依据：

疑似或确诊再障或血细胞发育障碍贫血

难治性单系发育异常血细胞减少

其他不明病因的血细胞减少


追踪检测


已诊断
PNH
的患者需要定期监测
P NH
克隆数目的变化，如果病情稳定，一年监测一次就可以
了。但是如果患者临床或血液学参数 发生变化，需要经常监测，这样可以为疾病的恶化或改善
提供真实信息。定期监测对使用
ecu lizumab
治疗的病人来说是非常有用的，但是到目前为止还
没有要求相隔多长时间进行检 测。如果具有溶血性贫血和血栓形成倾向的诊断为典型的
PNH
患
者，初次检测没有检 测出
PNH
克隆细胞，不需要重新检测。

对于再障患者检测出少量
PNH
克隆细胞，这时需监测
PNH
克隆数的变化，因为患者有可能发
展为溶 血性
PNH,
也意味着克隆数量增多了，但是
RCUD
患者还未报道有发展为 溶血性
PNH
可能。


流式细胞术检测
PNH

标本准备

首选
EDTA
抗凝外周血，肝素钠和
ACD抗凝也可以接受，不建议采用骨髓标本作检测，因为
由于细胞的分化发育会影响
GPI相关锚蛋白的表达从而导致结果较难解释。并且患有
MDS
的
PNH
病人 结果的解释也比较困难，因为
GPI
锚蛋白的异常表达跟
MDS
也相关，尤其
CD16
表达。

对于
PNH
检测，标本运输问题不大，冷 藏保存
7
天的标本也可以进行红细胞检测，但是我们
还是建议
48
小 时内进行检测，否则红细胞结果的解释将会受到影响。采集标本放置时间越长，
白细胞检测影响将会更大 ，白细胞内颗粒及抗体表达强弱均会受到影响，使得结果难以判断，
所以我们建议标本采集后
2 4-48
小时内进行检测。


标本来源

抗凝剂

标本量

标本最长保存时间

标本保存温度

裂解液要求

常规分析

高灵敏度分析

常规分析细胞群

标本准备

外周血（不建议骨髓检测）

EDTA;
肝素钠，
ACD
1-3ml
红细胞
7
天，白细胞
48h
内检测

24h
后，
4
度保存

白细胞检测时需要，可用商业化溶血素，建议使用氯化铵；红
细胞不需溶血素。

1%,
目标细胞群至少
5000
0.01%,
目标细胞群至少
250000
粒细胞群，单核细胞群（提供确证信息）

红细胞（或者白细胞检测异常的病例必做）

单独检测红细胞意义有限

淋巴细胞不建议检测


红细胞检测

红细胞膜
C D55
和
CD59
的缺失，被认为是引起
PNH
病理生理的主要原因 。
CD58
也是一个
GPI
相
关的红细胞抗原，但它同时又是跨膜蛋 白，因此结果解释较难判断，并且也无数据表明它的检
测意义大于
CD55
和
CD59
。红细胞检测目的就是明确鉴定和定量
GPI
相关锚蛋白缺失数
( III
型
细胞
)
，与正常细胞区别
(I
型细胞
) ,
或者部分缺失
(II
型细胞
(Fig. 1)
。但是单纯检测红 细胞
表面的缺失蛋白并不能对
PNH
做出准确判断因为溶血和输血已经完全影响了它的 真正数据，因
此，需要进一步检测白细胞。但是红细胞检测也是很重要的，它可以检测出
II< br>型细胞
PNH
患者，
同时，通过比较红细胞和白细胞数值，可以给临床提供更多 信息。


Figure 11
例
PNH
患者红细胞表 面
CD59
表达显示：
I
型细胞、
II
型细胞和
I II
型细胞

标本处理

白细胞检测相比，红细胞检测不需要溶血处 理，但要防止红细胞聚集。标本与抗体孵育后洗涤，
超过一次的洗涤可以排除非特异性结合和剩余的荧光 素，同时更容易区分
II
型和
III
型细胞。



Figure 2 PNH
患者红细胞
CD59
标记洗涤前后变化。洗涤前（
A
），
PE
荧光素过量或非特
异性结合，导致出现
II型红细胞而未检测到
III
型红细胞；洗涤后（
B
），消除试剂过量或非 特
异性结合，检测到
III
型红细胞。

选择抗体：
大多数 选择单个标记作为一个克隆检测方案，但也有少数病例会有先天性
CD55
，
CD59
缺失。
CD59
表达量高，很容易被检出，与其它抗体相比，
CD59
更容易鉴别
II
型和
III
性细
胞，不建议用间标。相比
CD59,CD55
在红细胞的表达较低，不建议用单一
CD55
做临床检测，因为不容易发现
II
型细胞。如果需要时，一般用
PE
标记
CD5 5,
也有将
CD55
，
CD59
用不同的荧光素
标记，同一 样本管处理，散点图分析。可以通过减少试剂量来降低红细胞的聚集，但需保证抗
体饱和。


Figure 3
与
Figure 1
相同病例，检测
CD55
在红细胞上的表达，虽然检测到
PNH
克隆数相同，
但是不能区分< br>II
型和
III
型红细胞。


获取，设门和分析：
一般红细胞用
FS
和
SS(LOG)
可以很容易与碎片或血小板区分 ，获取
5000
个红细胞既可以满足
1%
分析，另外也可以用
CD2 35a(,
红细胞糖蛋白抗体
)
来确定红细胞，
以准确排除碎片或其他细胞， 因为假如目标细胞混有了除红细胞外的其他细胞，容易被误以为
是
PNH
克隆细胞，同 时也相当于设置阳性对照，以确保标本与抗体充分混匀。但也要避免因
CD235a
与红细胞表 面抗原结合时引起红细胞聚集，所以要使用适当浓度的
CD235a
，使聚集现象
降到 最小。一般来讲，
FITC
荧光素聚集能力要小于
PE
。

II
型细胞的诊断还未标准化，为了避免不同标本表达差异大的问题，最好的解决方案是在
同一 标本中分辨出
II
型和
III
型细胞，又要保证
II
型细胞 不是由于
III
型细胞洗涤不充分造成的。
I
同时
,
还必须 记住
:
有输血史患者的标本
,GPI
相关蛋白表达与正常标本相比
,
荧光强度较弱，因此
,
有输血史患者检测结果
,
不同型细胞群会有重 叠部分。阴性对照的设立包括
:
用无抗体标记的细
胞去界定
III
型 细胞位置，用
GPI
表达正常的有抗体标记的细胞的位来界定正常

I
型细胞，

II
型细
胞位置即为阳性与阴性细胞群之间的位置。



Figure 4
分别用散点图和直方图显示少量红细胞表面
PNH
克隆数 。散点图（
A
）显示：运
用
CD235a/CD59
双参数很容易区 分
II
型（蓝色）和
III
型（绿色）红细胞；相同结果用直方图
（
B
）显示：由于存在大量
I
型红细胞，导致很难显示
II
型 和
III
型红细胞。



白细胞检测
-
常规分析

白细胞是检测
PNH
克隆 大小的最好目标细胞，但是利用淋巴细胞不适合做
PNH
克隆检测，因
为淋巴细胞寿命 长，
GPI
相关锚蛋白表达变异性很大。单核细胞和粒细胞都是非常好的目标细
胞，一 般来说这两种细胞检测出的克隆数目是一致的。分析两种细胞群可以更好地作出诊断

标本准备
：一般来说，做白细胞检测是先染色再裂解
RBC
，这样不会影响散射光的检测，比较先裂
RBC
解再染色的方法更容易设门。各种商业性裂解液都可以使用，但是对于粒细 胞较
少患者，建议使用氯化铵裂解液。

抗体选择
：以往都认为
CD 55
，
CD59
作为检测白细胞最好的抗体，但是与其它抗体相比，他们不
容 易区分阴阳性细胞群。
EQA
资料显示，
CD55
，
CD59
检测出的克隆数要小于
CD16
，
CD66b
。粒细
胞检测有很多 抗体，一般多用
CD16, CD24,
和
CD66b
。
CD16
在嗜酸性粒细胞和骨髓增殖性疾病
中的粒细胞上不表达。除此之外，
CD16
具有多态性，导致一些
CD16
克隆号不能识别
CD16
抗体，
因此
CD16
需与另外试剂搭配共同检测。
CD14
是表达在单核细胞上的
GPI
相关锚蛋白，但是不成
熟的单核细胞及树突状细胞也不表达
CD14,
因此在检测少量克隆细胞数作用有限。
CD48,CD157,
也可以检测白细胞，但是意义 有限，
CD55
在单核细胞表达较高，因此也可以检测单核细胞克隆
数。
< br>FLAER
是与
GPI
锚蛋白结合最特异的抗体，在
GPI
锚 蛋白缺失的单核细胞和粒细胞上，
FLAER
检测为阴性，是目前检测
PNH
克隆细胞最好的试剂。在早期
FLAER
研究中，使用干粉试剂，
由于其使用时的不方 便和不稳定性，导致在常规实验室中应用受限。而最近已经有液体状这种
试剂，它与
GPI锚蛋白结合能力上与固态相同，与其余单克隆抗体相比，稳定性和保存要求相
同：要求避光，不能长 期暴露高于
2-8
度环境。

设门和分析：
对于检测粒细胞上
GPI
锚蛋白缺失，设门很简单：
FSC/SSC
或
CD45/SSC.< br>单核
细胞较少时，需要用到单核细胞系抗体来找出单核细胞，在
MDS
病例或高 灵敏度检测病例中，
需要用到系别抗体，使得粒细胞门更精确。

常规检测，目标细胞 收集
5000-10000
，就可以使检测灵敏度达到
1%
，单核细胞较难， 但单
核细胞与粒细胞结果一致时，较少量单核细胞即可。一般来讲，一个门内，最好同时有阴性和
阳性
2
个细胞群，以准确区分阴阳性位置。因此，对于
PNH
克隆数目少的 病例，需要收集更多的
细胞，以找出表达
GPI
锚蛋白的细胞群，另外对于
P NH
克隆大的病例，用一个
GPI
锚蛋白抗体或
FLAER
以柱状图 参数就可以体现阴阳性细胞群，但大多数病例，需要用到
2
个不同的参数去找阴
性目标 细胞群。尤其
FLAER
的应用，可以找到
II
型细胞群，一旦找到粒细胞上
II
型细胞，要注
意检测红细胞上的
II
型细胞群，报告粒细胞克隆 数目时，是
II
型和
III
型的总和。