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肠系膜淋巴结细胞MLNs和固有层单核细胞LPMCs

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-26 11:55

今天晚上吃什么-

2021年1月26日发(作者:苗宝泰)

外周血单个核细胞的分离

3

1

4

2
密度梯度分离

从肘静脉无菌采集外周
EDTA
抗凝血
5ml
,用等量的生理盐水稀 释,将稀释血
液按
1

1
比例小心缓慢加在淋巴细胞分离液上,室温
800xg
离心
30rain
,离心后
分四层,上层为血浆、血液稀 释液和大部分血小板,下层为红细胞和粒细胞,中
间层是淋巴细胞分离液,
分离液和血浆交界部 位的乳白色混浊液体就是单个核细
胞层,小心吸取该层,加入
10

15ml
生理盐水洗涤,室温
250xg
离心
10min
,弃上
清; 再重复洗涤两次,弃上清。

3

1

4

3
外周血单个核细胞样品
RNA
的抽提和纯化

将分离好外周血单个核细胞样品的迅速加入
lml
trizol
,冰浴匀浆使细胞样

品充分裂解。转移到一
1

5ml DEPC
处理的无菌离心管中,加入
400ul
氯仿,

剧烈震荡混 匀,
4

12000rpm
离心
10min
。转移上清至另 一离心管中,加入等

体积氯仿:异戊醇
(24

1)
,剧 烈震荡混匀,
4

12000rpm
离心
10rain
。转 移

上清至另一离心管中,加入等体积氯仿:异戊醇
(24

1)< br>,剧烈震荡混匀,
4

12000rpm
离心
10min< br>。转移上清至另一离心管中,加入等体积异丙醇,震

荡混匀,室温放置
2mi n

4

12000rpm
离心
10min
。轻轻 移弃上清,防止吸

去沉淀,加入
lml
70
%乙醇,悬浮沉淀,
4

12000rpm
离心
10min
。轻轻移弃

上清,防止吸去沉淀,
4

12000rpm
离心
lmin
,用移液器吸干残余酒精,室

温空气干燥,使酒精挥发,加入
50ul DEPC
处理的灭菌水,溶解
RNA
。电泳

察看
RNA
的浓度和完整性。

在微量
Tube
中配制下列反应液,全量
50ul

RNA 20ug
1 0xDnase I Buffer 5ul
Dnase I(Rnase-free

5U

u1) 2ul
Rnase Inhibitor(40U

u1) 0

5ul
DEPC
处理水
upto 50ul
37
℃反应
20< br>.
30
分钟。加入
50ul

DEPC
处理水。加入
100ul(
等量
)
的苯酚/
氯仿/异戊醇
(25

24-1)
,充分混匀。离心,取上层
(
水层
)
移至另一

微量离心管中。加入
10ul(1

10

)< br>的
3
M
NaOAC(pH5

2)
。加入
250ul(2

5
倍量
)
的冷无水乙醇,.
20
C
放置
30

60
分钟。离心回收沉淀,用
70
%的冷


醇清洗沉淀,真空干燥。用适量的
DEPC
处理水溶解后,进行
Agarose
电泳确

认是否除去基因组
DNA


3

1

4

4 RNA
反转录上海交通大学博士学位论文

RNA(2u

xul
Primer(oligo dT)lul
RNase
抑制剂
0

5ul

DEPC
水至终体积
lOul
。轻轻混匀并在微量离心机低速将混合液收集在

底部。
75
水浴
5 min
,迅速冰浴
2rain
。离心收集混合液至管底。

每个反应管中顺序加入以下试剂:

5
×
RT Buffer 4ul
dNTP Mix(10 mM each) 1 ul
RNase
抑制剂
O

5ul

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