今天晚上吃什么-
外周血单个核细胞的分离
3
.
1
.
4
.
2
密度梯度分离
从肘静脉无菌采集外周
EDTA
抗凝血
5ml
,用等量的生理盐水稀 释,将稀释血
液按
1
:
1
比例小心缓慢加在淋巴细胞分离液上,室温
800xg
离心
30rain
,离心后
分四层,上层为血浆、血液稀 释液和大部分血小板,下层为红细胞和粒细胞,中
间层是淋巴细胞分离液,
分离液和血浆交界部 位的乳白色混浊液体就是单个核细
胞层,小心吸取该层,加入
10
.
15ml
生理盐水洗涤,室温
250xg
离心
10min
,弃上
清; 再重复洗涤两次,弃上清。
3
。
1
.
4
.
3
外周血单个核细胞样品
RNA
的抽提和纯化
将分离好外周血单个核细胞样品的迅速加入
lml
trizol
,冰浴匀浆使细胞样
品充分裂解。转移到一
1
.
5ml DEPC
处理的无菌离心管中,加入
400ul
氯仿,
剧烈震荡混 匀,
4
度
12000rpm
离心
10min
。转移上清至另 一离心管中,加入等
体积氯仿:异戊醇
(24
:
1)
,剧 烈震荡混匀,
4
度
12000rpm
离心
10rain
。转 移
上清至另一离心管中,加入等体积氯仿:异戊醇
(24
:
1)< br>,剧烈震荡混匀,
4
度
12000rpm
离心
10min< br>。转移上清至另一离心管中,加入等体积异丙醇,震
荡混匀,室温放置
2mi n
,
4
度
12000rpm
离心
10min
。轻轻 移弃上清,防止吸
去沉淀,加入
lml
70
%乙醇,悬浮沉淀,
4
度
12000rpm
离心
10min
。轻轻移弃
上清,防止吸去沉淀,
4
度
12000rpm
离心
lmin
,用移液器吸干残余酒精,室
温空气干燥,使酒精挥发,加入
50ul DEPC
处理的灭菌水,溶解
RNA
。电泳
察看
RNA
的浓度和完整性。
在微量
Tube
中配制下列反应液,全量
50ul
全
RNA 20ug
1 0xDnase I Buffer 5ul
Dnase I(Rnase-free
,
5U
/
u1) 2ul
Rnase Inhibitor(40U
/
u1) 0
.
5ul
DEPC
处理水
upto 50ul
37
℃反应
20< br>.
30
分钟。加入
50ul
的
DEPC
处理水。加入
100ul(
等量
)
的苯酚/
氯仿/异戊醇
(25
:
24-1)
,充分混匀。离心,取上层
(
水层
)
移至另一
微量离心管中。加入
10ul(1
/
10
量
)< br>的
3
M
NaOAC(pH5
.
2)
。加入
250ul(2
.
5
倍量
)
的冷无水乙醇,.
20。
C
放置
30
.
60
分钟。离心回收沉淀,用
70
%的冷
乙
醇清洗沉淀,真空干燥。用适量的
DEPC
处理水溶解后,进行
Agarose
电泳确
认是否除去基因组
DNA
。
3
.
1
.
4
.
4 RNA
反转录上海交通大学博士学位论文
RNA(2u
曲
xul
Primer(oligo dT)lul
RNase
抑制剂
0
.
5ul
补
DEPC
水至终体积
lOul
。轻轻混匀并在微量离心机低速将混合液收集在
底部。
75
水浴
5 min
,迅速冰浴
2rain
。离心收集混合液至管底。
每个反应管中顺序加入以下试剂:
5
×
RT Buffer 4ul
dNTP Mix(10 mM each) 1 ul
RNase
抑制剂
O
.
5ul
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