免疫组化中经常出现的问题及对策

2021年1月25日发(作者：贺敬之)
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化
染色过程要 经过很多步骤和环节，
而每一个步骤环节都可能影响到染色的最终结
果，
因此，
要做一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事，
这需要病
理技术人员和病理医师的 密切配合、
相互协调、
共同努力才能完成。
虽然免疫组
化染色可以存在各种问 题，但从染色结果看一般可分为两类：无色片
(
无阳性信
号
)
和“杂 音”染色片
(
有阳性信号
)
。

l
无色片

即染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象 ，
有两种可能。

1
．
1
真阴性结果整个染色过程没有出现问题，组织或细胞中与抗体相关的抗原
确实不表达。

1
．
2
假阴性结果即此阴性结果不是真实的反映。

1
．
2
．
1
切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞 。出现这种情况，可能是
病理医师对切片或抗体的选择错误。
或是技术员选错蜡块，
所 以获得正确的切片
进行染色是获得正确结果的前提。
故制作出合格的免疫组化切片不仅是技术员 的
事，病理医师也起着不可或缺的作用。

1
．
2
．
2
染色过程中的某一或某些环节出了问题。如： ①组织未进行抗原修复，
有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；
②抗体选用不当，选用了只能用
于冷冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；
③一抗失效。
虽然抗体 失效在理论
上是一个逐渐的过程，
但偶尔也会遇到突然失效的情况，
抗体长期不用和／ 或已
超过有效期是主要原因；
④

染色过程中漏掉了某一环节。
如忘 记加二抗或三抗。
或用了两次二抗而缺少三抗，或配制
DAB
时少了过氧化氢。有一种 简单的方法可
避免这种错误，
在三抗孵育结束时，
将切片上的三抗甩在一张白纸上。< br>再将配制
好的
DAB
滴一滴在白纸的三抗上。
观察是否出现棕色。如果出现则证明三抗和
DAB
的配制过程没有错误；如果这种
DAB
再滴 到切片上没有出现任何阳性信号，问题
一定是出在三抗以旆；如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗 或
DAB
及其配
制过程。
这种方法能迅速地帮助我们找出问题的原因；
⑤抗体未完全覆盖测试组
织，当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织。

解 决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了
表达，
说明染色的全过 程和所用试剂均没有问题。
此时测试片仍为阴性，
便是真
实的阴性，
说明组织 或细胞没有相应的抗原表达。
反之，
如果阳性对照也没有着
色，表明染色过程中的某个 或某些步骤出了问题。或试剂出了问题。应一

一寻
找原因。
阳性对照包括两 种：
一种称为自身对照或内部对照。
这是指在测试的切
片中存在已知的抗原，如正常淋 巴结中存在
T
和
B
细胞抗原。
CD20
或
CD3< br>都应该有
表达。
自身对照是一种比较理想的对照。
对照和要测试的组织、
细胞都在同一张
切片中，
都处于相同的试验条件下，
结果更可靠也更具有可比性。< br>在选择自身对
照片时，
最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，
这样有 利于对比。
另
一种称为外部对照。
有时在测试的切片中不存在已知的抗原，
如 在胃的标本中怀
疑存在恶性黑色素瘤，
需要用
HMB45
或
Mart
—
l
来检测，
而正常胃组织本身不存在
相关抗原，如果病变出现阳性 反应

结果，
就能提示是恶黑，
但如果出现阴性结果。
就无法确定是 组织自身不合黑色
素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试
组织之外的阳性对照称为外部对照。在实际工作中需要设立外部对照的情况很
多，
如果每一种 抗体都要选不同的阳性对照，
工作量会很大。
为了解决这个问题，
目前，
国内 、
外均有单位将多种不同组织集合在一起，
制成多组织切片、
“腊肠”
、“春卷”切片、组织芯片等，将其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为
阳性对照。
另外，
比较简单的方法是采用阑尾切片作为阳性对照，
因为与人体其
他组织器官比较阑 尾包含的组织种类较多，
含有上皮、
淋巴组织、
平滑肌、
间质、
神经 、血管和间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。

设立阳性对照是病理医师的工作 或责任，
而不是技术员的责任。
病理医师观
察了
HE
切片，
了解切片中是否有自身对照，
如果没有，
就应该告诉技术员采用阳
性对照。因此，病理 医师在免疫组化检测中的作用不可忽视。

2
“杂音”染色片

免 疫组化除正常的、
真实的阳性信号外常会遇到不正常的背景着色，
这些非
正常的着色称 为
“杂音”
染色。
“杂音”
染色种类繁多，
产生的原因也多种多样，
为了便于说明，将其归纳为下面几种。

2
．
1
全片着色

全片着色是指整个切片全部染上了颜色，
着色的强度可深可浅，
总之，分不清哪些组织是阳性哪些是阴性
(
图
1)
。出现这种现象有 几种原因。

2
．
1
．
1
抗体浓度过高

一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是每次使用
新抗体前应当对其工作浓度进行测试，< br>使每一抗体个体化，
找出适合自己实验室
的理想工作浓度，
即使是即用型的抗体 也应如此，
不能只简单地按说明书进行染
色。

2
．
1
．
2
抗体孵育时间过长或温度较高
解决办法是严格执行操作规程，最好随
身佩带报时表或报时钟，
及时提醒，
避免因 遗忘而造成时间延长。
现在流行的二
步法
(polymer)
敏感性很高，要 求一抗孵育的时间不是传统的
1 h
，而是
30 min
，
因此，要根据染色结果进行调整。

2
．
1
．
3

DAB
变质和显色时间过长
DAB
最好现用现配，如有沉渣应过滤后再用。配
制好的
DAB
不应 存放时间过长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧
原子与
DAB
产生反应 ，
而降低
DAB
的效力。
未用完的
DAB
存放在冰箱中几天 后再用，
这种看似节约的办法是不可取的。
DAB
的显色最好在显微镜下监控，达到理 想的
染色程度时立即终止反应。
当染色片太多时，
或用染色机时，
至少应对一 些新的
或少用的抗体显色时间进行监控，避免显色时间过长。

2
．
1
．
4
组织变干修复液溢出后未及时补充、染色切片 太多、动作太慢、忘记滴
液、
滴液流失等都是造成组织变干的原因。
解决的办法是操作 要认真仔细，
采用
DAKO(
或
PAP Pen)
笔在组织周围画圈，可以有效避免液体流失，也可提高操作速
度。

2
．
1
，
5
切片在缓冲液或修复液中浸泡时间过长
(>24
h)
有些实验室喜欢前一 天
将切片脱蜡至修复，
第二天加抗体进行免疫组化染色。
如果将装有切片和修复液的容器放在
4
℃冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温下，特别是炎热的
夏 天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

2
，
1
．
6
一抗变质和质量差的多克隆抗体
< br>注意抗体的有效期，过期的抗体容易
不显色或背景着色。用新购的抗体时最好设立阳性对照或用已 用过的抗体作比
较。

2
．
2
切片边缘着色

切片边缘着色也是一种常见现象，
这种现象称为边缘效应。
产生的原因有几种。

2
．
2
．
1
组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂 浮在液体中，每次清洗不易
将组织下面的试剂洗净所致。
解决的办法：
制备优质的胶片
(APES
或多聚赖氨酸
)
，