免疫组化注意事项

2021年1月25日发(作者：平新乔)

(
四
)
注意事项


1.
正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以
保证实验结果的 准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或
B
SA
等封闭 。


2.
在
ELISA
中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括
:

(1)
固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，
如聚氯乙烯、聚苯乙 烯、
聚丙酰胺和纤维
素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是
40
孔聚苯乙烯凹孔板。不管
何种载体，
在使用前均可进行筛选：
用等量抗原包被 ，在同一实验条件下进行反应，观察其
显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。


（
2)
包被抗体
(
或抗原
)
的选择： 将抗体
(
或抗原
)
吸附在固相载体表面时，要求纯度要好
,
吸附时一般要求
PH
在
9.0
～
9.6
之间。吸附温度，时 间及其蛋白量也有一定影响
,
一般多采
用
4℃18～
24
小 时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度
(0.1
、
1.0和
10
μ
g
／
ml
等
)
进行包被后， 在其它试验条件相同时，观察阳性标本的
OD
值。选择
OD
值
最大而 蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为
1
～
10
μ
g
／
ml
。


(3)
酶标记抗体工作浓度的选择：首 先用直接
ELISA
法进行初步效价的滴定
(
见酶标记抗体
部份)
。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分
别 为不同的稀释度
)
在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。


(4)
酶的底物及供氢体的选择：
对供氢体的选择要求是价廉、
安全、有明 显地显色反应，而
本身无色。
有些供氢体
(
如
OPD
等)
有潜在的致癌作用，
应注意防护。
有条件者应使用不致癌、
灵敏度高的 供氢体，如
TMB
和
ABTS
是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后 ，应加
入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间，
以
10-30
分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配
制，尤其是
H2O2
在临用前加入。

常见问题处理：

免疫组化常见问题的处理


< br>当免疫组化染色没有出现预期结果时，
应系统地查找原因，
而每一次只能排除一种可能的 原
因。


对照
/
标本无染色


① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③ 对照抗体的标签确认是 否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这
一点是非常重要的。
比如，如果 一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或
一抗是小鼠的
IgM
一抗， 二抗必须是山羊
/
兔抗小鼠的
IgM
（不是
IgG
）二抗。

④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤ 检查抗体的有效期和保存 条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司
的抗体均要求在
4~8℃条件下保 存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机
溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦ 检查 色原
/
底物溶液，
最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶< br>液中，
如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。
需要注意的是，有些底物在 制
成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹 配，
溶液的
pH
值很重要，
与过氧化物酶底物匹配的溶液中
不应含有 叠氮钠。

⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。


弱阳性


如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：

① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量
和质量。

② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须
用抗 原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，
至于使用哪一种方法，
应参照生产
厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/
时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给
出一定的使用范围，
但 是由于使用者的标本来自各种组织，
处理过程也不尽相同，
所以应参
照使用范围，对所 使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的
稀释。

⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反
应良 好，
而标本弱阳性，
则可能是由于阳性对照不是同一种组织、
或固定方式不同等原因所
致。


非特异性染色


① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步