PCR实验常见问题

2021年1月25日发(作者：弘历)
【实验】
PCR
常见问题总结

作者
:
gene121
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发布
: 2005-07-04
PCR
产物的
电泳
检测时间一般为
48h< br>以内，有些最好于当日电泳检测，大于
48h
后带型不规则甚致消失。

一
.
假阴性，不出现扩增条带



PCR
反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的
质量及活性

④PCR
循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。



模板：
①模板中含有杂蛋白质，
②模板中含有
Taq
酶抑制剂，③模板中蛋白
质没有消化除净，
特别是染色体中的组蛋白，
④在提取制备模板时丢 失过多，
或
吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，
模板核酸提取过程出了毛病，
因而要配制有效而稳定的消
化 处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。



酶失活：
需更换新酶 ，
或新旧两种酶同时使用，
以分析是否因酶的活性丧失
或不够而导致假阴性。需注意的 是有时忘加
Taq
酶或溴乙锭。



引物：引物质量、引 物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是
PCR
失败或扩
增条带不理想、
容易 弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，
两条引
物一条浓度高，一条浓度低 ，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好
的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看
O D
值，更要注重引物原液做琼脂糖凝
胶
电泳
，一定要有引物条带出现，而且两 引物带的亮度应大体一致，如一条引物
有条带，
一条引物无条带，
此时做
PC R
有可能失败，
应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，
一条亮度低 ，
在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度
小量分装保存，防止多次冻融或长期放
冰箱
冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不

够，引物之间形成二聚体等。



Mg2+
浓度：
Mg2+
离子浓度对
PCR
扩增效率影响很大，浓度过高可降低
PCR扩增的特异性，
浓度过低则影响
PCR
扩增产量甚至使
PCR
扩 增失败而不出扩增条
带。



反应体积的改变：通常进行
PCR
扩增采用的体积为
20ul
、
30ul
、
50ul< br>。或
100ul
，应用多大体积进行
PCR
扩增，是根据科研和临床检 测不同目的而设定，
在做小体积如
20ul
后，再做大体积时，一定要模索条件，否则 容易失败。



物理原因：变性对
PCR
扩增来说相当重 要，如变性温度低，变性时间短，极
有可能出现假阴性
;
退火温度过低，可致非特异性 扩增而降低特异性扩增效率退
火温度过高影响引物与模板的结合而降低
PCR
扩增效率 。
有时还有必要用标准的
温度计，
检测
一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和 延伸温度，这也是
PCR
失败
的原因之一。



靶序列变异：
如靶序列发生突变或缺失，
影响引物与模板特异性结合，
或因
靶 序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其
PCR
扩增是不会成功的。

1
假阳性



出现的
PCR
扩增条带与 目的靶序列条带一致，
有时其条带更整齐，
亮度更高。



引物设计不合适：
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，
因而在进行
PCR< br>扩增时，扩增出的
PCR
产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容
易 出现假阳性。需重新设计引物。



靶序列或扩增产物的交叉污染：
这种污染有两种原因：
一是整个基因组或大