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ELISA实验

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-25 15:46

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2021年1月25日发(作者:吕晶晶)
ELISA


ELISA
是酶联接免疫吸附剂测定
( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )
的简称。它是继免疫荧 光
和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自
70
年代初问 世以来,
发展十分迅速,
目前已
被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。





(

)

原理

ELISA
是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结 合起来的
一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体
──
聚苯 乙烯微量滴定板的孔中进行,
每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验 结果的特异性与稳定性。在实
际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即
:用于检测抗体的间接法
(

a)
、用于检测抗原
的双抗体夹心法
(

b)
以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是
ELISA
双抗体
夹心法及
ELISA
间接法。




(

)

操作步骤



方法一

用于检测未知抗原的双抗体夹心法
:


1.

包被:

0.05M PH9.
牰碳酸盐 包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为
1

10μg

ml

在每个聚苯
乙烯板的反应孔中加
0.1ml

4


过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗
3
次,每次
3
分钟 。
(
简称
洗涤,下同
)




2.

加样:加一定稀释的待检样品
0.1ml
于上述已包被之反应 孔中,置
37


孵育
1
小时。然后洗涤。
(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔
)




3.

加酶标抗体:
于各反应孔中,
加入新鲜稀释的酶标抗体
(
经滴定后的稀释度
)0.1ml

37


孵育
0.5

1
小时,洗涤。



4.

加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的
TMB
底物溶液
0.1ml

37


10

30
分钟。



5.

终止反应:于各反应孔中加入
2M
硫酸
0.05ml




6.

结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应 孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反
应为无色或极浅,
依据所呈颜色的深浅,
“+”


-

号表示。
也可测
OD
值:

ELISA
检测仪上,

450nm(


ABTS
显色,则
410nm)
处,以空白对照孔调零后测各孔
OD
值,若大于规定的阴性对照
OD
值的
2.1
倍,即为阳性。



方法二

用于检测未知抗体的间接法:







用包被缓冲液将已知抗原稀释至
1
10μg

ml








每孔加
0.1ml

4
℃过夜。次 日洗涤
3
次。























加一定稀释的待检样品
(< br>未知抗体
)0.1ml
于上述已包被之反应孔








,

37
℃孵育
1小时
,
洗涤。
(
同时做空白、阴性及阳性孔对照
)















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