hlv-
PCR
常见问题分析及对策
(
无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)
问题
1
：无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无
原因
:
1.
模板
:
含有抑制物，含量低
对样品不合适
3.
引物设计不当或者发生降解
4.
反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策
:
1.
纯化模板或者使用试剂盒提取模板
DNA
或加大模板的用量
2.
更换
Buffer
或调整浓度
3.
重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.
降低退火温度、延长延伸时间
问题
2
：非特异性扩增
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
原因：
1.
引物特异性差
2.
模板或引物浓度过高
3.
酶量过多
2+
浓度偏高
5.
退火温度偏低
6.
循环次数过多
对策：
1.
重新设计引物或者使用巢式
PCR
2.
适当降低模板或引物浓度
3.
适当减少酶量
4.
降低镁离子浓度
5.
适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.
减少循环次数
问题
3
：拖尾
现象：产物在凝胶上呈
Smear
状态。
原因：
1.
模板不纯
不合适
3.
退火温度偏低
4.
酶量过多
、
Mg
2+
浓度偏高
6.
循环次数过多
对策：
1.
纯化模板
2.
更换
Buffer
3.
适当提高退火温度
4.
适量用酶
5.
适当降低
dNTP
和镁离子的浓度
6.
减少循环次数
问题
4
：假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原因：
靶序列或扩增产物
的交
*
污染
对策：
1.
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2.
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管
及加样枪头等均应一次性使用。
3.
各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存
PCR
产物的电泳检测时间
一般为
48h
以内，有些最好于当日电泳检测，大于
48h
后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR
反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，
④
PCR
循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有
Taq
酶抑制剂， ③模板中蛋白质没有消
化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，
或吸入酚。⑤模
板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处
理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳
定的消化处理液，其程序亦应
固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而
导致假阴性。需注意的是有时忘加
Taq
酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是
PCR
失败或 扩增条带不
理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条
引物一条浓度
高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单
位 。②引物的浓度不仅要看
OD
值，更要注重引物原液做琼
脂糖凝胶电泳，一定要有
引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条
< br>带，此时做
PCR
有可能失败，应和引物合成单
位协商解决。如一条引物亮度高 ，一条
亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融
或长期放冰箱冷藏部分，导致引
物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不
够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+
浓 度：
Mg2+
离子浓度对
PCR
扩增效率影响很大，浓度过高可降低
PCR
扩增的特
异性，浓度过低则影响
PCR
扩增产量甚至使PCR
扩增失败而不出
扩增条带。
反应体积的改变：通常进行
PCR
扩增采用的体积为
20ul、
30ul
、
50ul
。或
100ul
，应用多
大体积进行
PCR
扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，
在做小 体积如
20ul
后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对
PCR
扩增来说相当重 要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出
现假阴性
;
退火温度过低，可 致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退
火温度过高影
响引物与模板的结合而降低< br>PCR
扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，
检测一下
扩增仪或水溶锅内的变性、
退火和延伸温度，
这也是
PCR
失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某
段缺失使引物与模板失去互补序列，其
PCR
扩增是不会成功的。
假阳性
出现的< br>PCR
扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源 性，
因而在进行
PCR
扩增
时，
扩增出的
PCR
产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，
容易出现假阳
性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交
叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心
轻柔，防止
将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或
器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使
用。
③必要时，在加标本
前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污
< br>染，
这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩
增出
PCR
产物，而导致假阳性的产生，可用巢式
PCR
方法 来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR
扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带
与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序
列不完全互补、
或引物聚合形成二聚体。二是
Mg2+
离子浓度过高、退火温度过低，及
PC R
循环次数
过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出
现非特异条带而另一来源的酶
则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引
物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降
低引物量，适当增加模板量，减少循环次
数。④适当提高退火温度或采用二温度点法
(93
℃变性，
65
℃左 右退火与延伸
)
。
出现片状拖带或涂抹带
PCR
扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量
差，
dNTP
浓度过高，
Mg2+
浓度过高，退火温度过低，循环次 数过多
引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少
dNTP
的浓度。 ③适当降低
Mg2+
浓
度。④增加模板量，减少循环次数。
克隆
PCR
产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。
1
：
1
（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比
1
：
8
或
8：
1
也行。应测定比值范围。连接用
5ul 2X
连接液
, 5 0ng
质
粒
DNA,1Weiss
单位的
T4
连接酶，插入 片段共
10ul
。室温保温
1
小时，或
4oC
过夜。在这< br>2
种温度下，缺
T-
凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温
1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需
4oC
过夜。
PCR
产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引 物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高
比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插 入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A
）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄 抗型的菌落。
B
）转化完整质粒，计算菌落生长数 ，测定转化效率。例如，将
1ug/ul
质粒
1:100
稀释
,1u l
用于
100ul
感受态细胞转化。用
SOC
稀释到
100 0ul
后，用
100ul
铺板。培养过夜，产生
1000
个菌落。转 化率为：
产生菌落的总数
/
铺板
DNA
的总量。铺板DNA
的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用
10ng DNA
，
用
SOC
稀释到
1000u
后含
10 ng DNA
，
用
1/10
铺板，
共用
1 ng DNA< br>。
转化率为：
1000
克隆
X10
（
3
次方 ）
ng /
铺板
1 ng DNA ug=10
（
6
次方）
cfu/ ug
转化
pGEM-T< br>应用
10
（
8
次方）
cfu/ ug
感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C
）如用
pGEM-T
正对照，
或
PCR
产物，产生
>20-40
蓝斑（用指定步骤
10
（
8
次方 ）
cfu/ ug
感受态细胞）
，表明载体失去
T
。
可能是 连接酶污染了核酸酶。
T4 DNA
连接酶（
M1801
，
M180 4
，
M1794
）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的
T4 DNA
连接酶替换。
D
）用
pGEM-T
或
pGEM-T Easy
载体，连接
pGEM-T
正对照，转化高频率感受态细胞（
10
（
8
次 方）
cfu/ug
）
,
按照指定的实验步骤，可得
100
个 菌落，其
中
60%
应为白斑，如产生
>20-40
蓝斑
,
没有菌落或少有菌落，连接有问题。
对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A
）连接用室温保温
1
小时，能满足大多数克隆，为提 高效率，需
4oC
过夜。
B< br>）插入片段带有污染，使
3`-T
缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和< br>pGEM-T
正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需
纯化，或重新制 备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使
pGEM-T
或
pGEM-T Easy
载体
3`-T
缺失。
C
）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受
UV
过度照射，时有 发生。
UV
过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，
DNA
必需重新纯化。
D
）带有修复功能的耐热
DN A
聚合酶的扩增产物末端无
A
，后者是
pGEM-T
或
pG EM-T Easy
载体克隆所需。加
Taq DNA
聚合酶和核苷酸可在末端加
A
。
详情查
pGEM-T pGEM-T Easy
载体技术资料（
TM042
）。
E
）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率 地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如
SURE
细胞
PCR
疑难解答
当
PCR
结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：
将
PCR
反应的试管与反应板紧贴。
当酶反应混合物以
70
℃
“
热启动
”
开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一 下，因为在
0.2-ml
的
PCR
管中不能均匀传热。
不要随意减少
dNTP
的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
对于有问题的
PCR
反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等 ，先尝试加
Taq
酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常
PCR
扩增。< br>
没有扩增产物：
在提供
MgCl2
缓冲液中，以
0.25mmol/L
为梯度增加
MgCl2
浓度；无
MgCl2
的缓冲液以
0.5 mmol/L
为梯度增加
MgCl2
浓度。
泳道中出现 模糊条带，如果
DNA
模板中存在
RNA
，则按上述提示浓度补加
M gCl2
，因为在
PCR
反应中可能缺少游离的
Mg2+
。
检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
检查模板和引物的用量。
增加循环次数和
/
或模板
DNA
的用量。
泳道中出现模糊条带：
减少循环次数或模板
DNA
的用量。
提高退火温度，但不要超过
68
℃。
重新设计引物或设计更长的引物。
其他值得注意的条件：
建议使用
0.2-ml
薄壁管。厚壁管在
92
℃时不能有 效地使模板变性。
最佳反应体积为
50ml
，推荐用
3 0ml
矿物油覆盖（对盖子加热的
PCR
仪可以不加）
。
大多数反应中，
0.75ml
（
0.5~1ml
）的酶量在大多数情 况下可以得到满意的结果。
建议使用
1.75mmol/L MgCl2
∶
350mmol/L dNTP
或
2.25mmol/L MgCl2
∶
500mmol/L dNTP
组合的混合物。
然而要得到最佳 结果，
优化
Mg2+
的浓度是必需的。
基因组
DNA
模板的质量显著影响
PCR
反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测
DNA
的长度。
DNA
片段长度可以超过
50kb
，传统的基因组< br>DNA
能扩增片
段至
10kb
。
要扩增 更长的片段应使用超纯或高分子量的
DNA
。请查阅高分子量
DNA
提取操作 过程相关文献。
降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段
P CR
扩增时，引物长度一般为
24~34
个核苷酸，溶点在
60~68
℃间。使用这类引物可提高
PCR
反应的
退火温度来增加反应的特异性。这点非常重 要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。
变性：第一步变 性在
94
℃下进行
2
分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（
94
℃下进行
20--30
秒）
，除非模板中富含
GC
，则95
℃下变性
30
秒。这可以防
止
DNA
脱嘌啉和链断 裂，对于所需扩增的基因组
DNA
片段终长度超过
12 kb
时，应该尽可能的降低变性温度。
延伸：
68-- 72
℃下进行延伸操作。
循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若
PCR
仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增
10kb
片断时，延伸时间 用
10
分钟替代原来的
8
分钟。
长片断
PCR
系统扩增的片断其
3’
-
末端带有一个突出的
A
， 因此建议采用
T/A
克隆。若要进行平端可隆，可用
Klenow
酶和
T4 DNA
多聚酶将
PCR
产物补平后
再进行。
< br>测序时因酶的混合物带有
3’→5’
外切酶活性，用
Sanger
方法 进行测序不能产生均一的（染色体）带型。
引物设计：
一般长度
20-30bp
；
至少
50%
的
GC
含量；
避免引物二聚体和二级结构；
引物对的
Tm
值应该接近。
hlv-
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