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免疫组化染色过程中存在的问题原因分析及对策

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-25 15:42

我不是药神豆瓣-

2021年1月25日发(作者:卜尔昌)























良好的免疫组化染 色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染
色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或 环节都可能影响到染色的最终结
果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。 需要
病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免
疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,
但从染色的结果看,
一般可分为两类:无 色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。





一、

无色片




染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见
的现象,出现这种现象,有两种 可能:
1
、真阴性结果:整个染色过程没有出现
问题,组织或细胞确实不表达与抗体相 关的抗原。
2
、假阴性结果:即此阴性结
果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种 情况:(
1
)、切片中根本就不包
含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况,要麽是 病理医生选择错了切片或
抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确< br>结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病
理医生也起着不可缺 少的作用。

2


染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;
或选用了只能用于冰冻组 织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,虽
然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇 到突然失效的情况,抗体
长期不用和
/
或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过 程中漏掉了某一环
节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制
DAB时少了
过氧化氢。
为了避免这种简单的错误,
有一种简单的方法:
在三抗 孵育结束时,
将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的
DAB
滴一滴在白纸的三 抗上,
观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和
DAB
的配制过程没有错误。如果
这种
DAB
再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如
果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗
DAB

DAB
的配制过程。这种 简单方
法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。





解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对
照有了表达,说 明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为
阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没 有相应的抗原表达。反之,如果阳
性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了 问题。
应一一寻找原因。
阳性对照包括两种,
一种称为“自身对照”或“内部对照”,
这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在
T

B< br>细
胞抗原,
CD20

CD3
都应该有表达。自身对照是一种 比较理想的对照,对照和
测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也< br>更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织
的部分,这样有利于 对比。另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不
存在已知的抗原,
如在胃的标本中怀疑 是恶性黑色素瘤,
需要用
HMB45

Mart-1
来检测,在正常 的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结
果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结 果,就无法确定是本身组织中不含
黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照 。这种
在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对
照的情况很 多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了
解决这个问题,目前国内外有单位将多 种不同组织集成在一起,制成多组织切
片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等,其连续切片储备待用, 需要时取出
一张便可作为阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,
因为与 人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,
如有上皮、
淋巴组织、
平滑肌、间质 、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗
体。





设立阳性对照是病理医生的任务或责任,而不是技术员的责任。病理
医生 观察了
HE
切片,了解切片中是否有自身对照,如果没有,就应告诉技术员
采用阳性对 照。因此,病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。

抗体未覆盖上测试组织:
当 多块散开的小组织染色时,
可能漏掉某块组织染色。






二、“杂音”染色片






免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,
这些非正常的着 色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多,产生的原因也
多种多样,为了便于说明,笔者将其归纳为 下面几种。





1


全片着色





全片着色是指整个切片全都染 上了颜色,
着色的强度可深可浅,
总之,
分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现 这种现象的原因有:







1< br>)、抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法
是,每次使用新抗体前应当对其工 作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到
适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如 此,不能只简单
的按说明书进行染色。






2
)、抗体孵育时间过长或温度较高:解决办法是,严格执行操作规
程,最好随身佩 带报时表或报时钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法(
Polyme r
)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的
1
小时,而是
30
分钟,因此,要根据染色结果进行调整。





3
)、
DAB
变质和显色时间太长:
DAB
最好现用现配,如有 沉渣应进
行过滤后再用。配制好的
DAB
不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下, 过
氧化氢也会游离出氧原子与
DAB
产生反应而降低
DAB
的效力, 未用完的
DAB

放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。
D AB
的显色最好在显微
镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或 用染
色机时,这样做似乎不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监
控,避免显色 时间过长。






4
)、组织变干 :修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动
作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的 原因。解决的办法是操作
要认真仔细,采用
DAKO
笔或
PAP
Pen
在组织周围画圈,可以有效的避免液体
流失,也能提高操作速度。






5
)、切片在缓冲液或修复液中浸泡时 间太长(大于
24
小时):原
因上不清楚,但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片 脱蜡至修复,第二天
加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在
4&ord m;C
冰箱

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