Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测(1)

2021年1月25日发(作者：雷从民)
Id1
启动子的荧光素酶报告基因载体的构建
及其在肝癌
HepG2
细胞中的活性检测
(1)



丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰



【摘要】

目的：扩增
Id1
启动子基因，构建
Id1
启动
子的报告基因载体
.
方法：
通过
PCR
及双酶切方法，
从
HepG 2
细胞基因组
DNA
中获得
Id1
基因编码序列上游包含不同长度< br>碱基的两段
Id1
启动子序列；分别克隆到报告基因
pGL3
enha ncer
载体上，
构建包含两段不同长度
Id1
启动子的报告
基因载 体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝
癌
HepG2
细胞系；采用双荧光 素酶报告基因系统评估
Id1
启
动子活性
.
结果：经
PCR
方法扩增出大小分别为
1096 bp
和
266
bp
的两段不同长度的
Id1
启动子片段， 序列测定其编码
序列及读框正确，酶切鉴定亚克隆序列正确
.
瞬时转染
HepG2
后经报告基因检测，两段启动子均具有转录活性
. 结
论：成功构建了
Id1
启动子的报告基因载体，为进一步研究
Id1< br>启动子和肝癌的关系奠定了实验基础
.


【关键词】

分化抑制因子



0
引言



Id
蛋白即分化抑制或
DNA
结合抑制蛋白是缺少
DNA
结 合
HLH
转录因子的显性负性
调节分子
.
已知哺乳动物
I d
蛋白家族有
Id1
～
Id4
等
4
位成


员
.
它们可调节多种细胞进程，
包括细胞生长、
衰老、
分化、
凋亡和血管生成等
［
1
］
.
研究
［
2
］
表明
Id
蛋白特别是
Id1
，
可通 过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳
动物细胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增 殖所必
需的关键因子
. Id1
可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌
发生风险的有用指标，

并且可作为治疗肝癌的靶向分子
.
我们拟构建两段包含不同长度
Id1
启动子片段的报告基因载
体，

转染
HepG2
细胞后检测两段
Id1
启动子的活性
.


1
材料和方法



材料
pGL3
Dual
enhancer
载体，内参照
pRL
TK
载体和
luciferase
reporter
Kit
；
LipofectaminTM
Reagent
和
T4
DNA
连接酶；细胞基因组
DNA
提取试剂盒；高保真
Taq
DNA
聚合酶；
Plasmid Miniprep Kit
和
Gel Extration Kit
；
DNA
marker:
GeneRulerTM
100
bp
DNA
ladder
Plus
和
GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder
；

胰蛋白胨及酵母提取物；

限制性内切酶
Hind
Ⅲ，
Kpn
Ⅰ；

其余试剂均为国产分析纯
.
TD20/20
荧光照度计；
HepG2
细胞和
JM109
菌株均为本实验
室保存
.


方法



启动子报告基因载体的构建



引物设计自
XX
网站数据库检索获得
Id1
启 动子序列的
-3000
～
100
部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并


在上游引物
5
′端加入
Kpn
Ⅰ的酶切位点
GGTACC
，在下游引
物
5
′端加入
Hind
Ⅲ的酶切位点
AAGCTT.
从转录起始零点开
始，

两段启动子片段长度分别为
:
－< br>1019
～＋
76
和－
189
～
＋
76.
上游引物分别为
Fw1
：
gggtaccgggagcacgggaacta gc
和
Fw2
：
gggtaccccacccttgctgttctga；
下
游
引
物

Rv
：
aagcttggagaatgggcaaagcgaaa.


细胞培养及模板提取将
HepG2
细胞用含
100 mL/L
胎牛
血清的
RPMI 1640
培养基在
37
℃，
50 mL/L CO2
的孵箱中培
养
.
收集对数生长期细胞约
1
×
107
，
以细胞基因组
DNA
提取
试剂盒提取基因组
DN A.


启动子基因的克隆以
HepG2
细胞基因组
DN A
为模板，用
Fw1
为上游引物、
Rv
为下游引物，经预实验选择< br>94
℃变性
1
min
，
55
℃退火
1 min
，
72
℃延伸
1 min,
共
30
个循环，获
得一长度为
1096 bp
的片段，命名 为
Id1p1
；选用
Fw2
为上
游引物、
Rv
为下 游引物，
经预实验选择
94
℃变性
30
s
，
54
℃
退火
30
s
，
72
℃延伸
45
s,
共
30
个循环，
获得一长度为
266
bp
的片段，命名为
Id1p2.
用
10 g/L
琼脂糖 凝胶进行电泳
获得
2
条鉴定条带，大小分别约为
1100
bp
和
260
bp.
参照
试剂盒的操作说明回收并纯化
.


启动子载体的构 建与测序将荧光素酶报告基因
pGL3
enhancer
载体分别行
Kpn< br>Ⅰ和
Hind
Ⅲ双酶切，
回收
.
同时将
之前回收的
PCR
产物同样经
Kpn
Ⅰ和
Hind
Ⅲ双酶切及琼脂糖< br>

凝胶电泳，分别回收约
1100 bp
和
260 bp
条带
.
使之分别
在
T4
连接酶的作下与
pG L3
enhancer
载体以
3
∶
1
和
10
∶
1
的浓度比于
16
℃连接
12
h
，使
Id1p1
和
Id1p2
基因序列插
入无启动子的
pGL3
enhancer
载体中
.
以低温
CaCl2
法转
化感 受态细菌，涂布于含氨苄青霉素的固体
LB
培养皿上，
12 h
后挑取单克隆菌落，以质粒小量提取试剂盒提取质粒
.
行
Kpn
Ⅰ和
Hind
Ⅲ双酶切并测序鉴定阳性克隆的重组质粒
.
最终构建成重组报 告基因载体
Id1p1/PGL3
和
Id1p2/PGL3.


启动子载体转染肝癌
HepG2
细胞系将两种重组质粒、空
载体
pG L3
enhancer
和内参照
pRL
TK
载体转化的阳性
菌株，在
LB
培养基中
37
℃摇床培养过夜，按质粒提取说明
分别提 取
Id1p1/pGL3
，
Id1p2/pGL3
、
空载体
pGL3
和
pRL
enhancer
TK
的
DNA
，经紫外分光光度仪测定
A260
nm
值
.
按
照
LipofectaminTM Reagent
脂质体转染系统说明， 于转染
前
1
日将细胞接种于
24
空板，
5
×
104/
孔，第
2
日当细胞约
90%
融合时，每孔分别定量加入< br>Id1p1/pGL3
μ
g
，
PRL
TK
内参照载体
100 ng
，
LipofectaminTM 5
μ
L
和无血清培养
基
200
μ
L. 6 h
后换含
FBS 100 mL/L
的
RPMI 1640
，培养
18 h.


报告基因活性的检测瞬时转染
24 h
后收集、裂解细胞，
离心取上清，
用
Dual
Luciferase
Reporter
Assay
System
在
TD20/20
荧光照度计上测定裂解上清内
Luc
活性
,
计算