用氨基酸直接分析法测定色氨酸

2021年1月24日发(作者：陶大钊)
用氨基酸直接分析法测定色氨酸


摘要：
本文建立了一种采用离子 色谱法，
积分脉冲安培检测器从氨基酸直接分析测定色氨酸
的方法。选择的色谱条件为：
AminoPac PA10
分析柱，水，乙酸钠和
氢氧化钠
三种溶液梯度
淋洗，积分脉冲安培检测。选择不同的梯度形成两种方法，他们的检测限在
0.12-0.14
μ
M
之间（
10
μ
L
进样）
，定量限在
0.14-0.46
μ
M
之间，
1
μ
M
–
100
μ
M
成线形，
RSD
小于
2.45
％，可以用于具体定量。



关键词：离子色谱；色氨酸；
AminoPac PA10


由于在蛋白质和多肽水解制样过程中色氨酸会发生化学分解，
所以蛋白质 和多肽中色氨
酸的测定是比较困难的。
因此人们发展了许多方法来单独保存和测定这种氨基酸。
为了保存
色氨酸，
可将一些硫醇抗氧化剂如巯基乙酸、
亚硫基二乙酸或十二烷 基硫醇
[1,2]
等被加入到
6
N
盐酸溶液中。加入苯酚的做法也 有报道
[3-5]
。另外采用对甲基苯磺酸
[6]
，含
3-(2-< br>氨基
乙基
)
吲哚的甲基磺酸
[7]
和巯基甲基磺酸
[ 8,9]
取代盐酸进行样品水解可以改善色氨酸的回收
率。


< br>现在常用的测定色氨酸的方法是
AOAC
推荐出版的方法
[10]
。该 方法使用氢氧化钠水
解，
水解后调节
pH
，
再经过离心处理，
则所得到的清液就可以用氨基酸分析仪进行测定了。
阳离子交换色谱测定氨基酸常常需要
1 h
时间，而反相色谱则仅仅需要
45 min [11]
。为了得
到高到中级 皮摩尔的色氨酸测定灵敏度，这两种方法或需要柱后衍生，或需要柱前衍生。


< br>在本应用方法中，
我们将氨基酸直接分析方法应用于蛋白质、
多肽、
细胞培养液 和发酵
液中色氨酸的测定。
该方法既能用
阴离子交换色谱
法
(Ami noPacTM PA10)
直接分离常见氨基
酸，又能用积分脉冲安培检测方法
(I PAD)
直接检测这些氨基酸
[12,13]
。

在本方法中，我们
给出了专门为从自由氨基酸、糖和多肽片段中快速将色氨酸淋洗分离出来的等度色谱程序。
使用 该方法色氨酸可被以非常高的灵敏度检测（低皮摩尔水平进样）
。该方法将色谱运行时
间减少至
12 min
，与传统方法相比，大大提高了分析效率。



1
实验部分



1.1
仪器与试剂



Dionex
BioLC
色谱系统，由以下部件组成：
GP50
或
GS50
梯度泵，微孔，
PEEK
材料
流路， 带有脱气装置；带有
氨基酸
金电极的
ED50
电化学检测器；
AS5 0
自动进样器；配有
25
μ
L
进样环的可控温柱温箱；
包 括三个
2-L
塑料淋洗液瓶和压力表的
EO1
淋洗液组织器。



PeakNet
色谱工作站
。



去离子水，
17.8
M
Ω
-cm
或更好；
无水乙 酸钠
(Dionex
公司
AAA
专用
)
；
50%< br>氢氧化钠
浓溶液
(w/w)(Fisher)
；
RBS-35
洗涤剂；
一水葡萄糖
(J.T. Baker)
；
标准：
色氨酸(sigma)
；
样品：
Luteinizing
Hormone- Releasing
Hormone
黄体激素
-
释放激素
(LH-RH;
Sigma)
；
FW
1182.3
pGlu-His-Trp- Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.
样品干重包含
90%
的多肽，该多肽的纯度

为
98%。每个分子中含一个色氨酸残基。牛血清白蛋白
(BAS)
，
7%
。此试 剂为
NIST
标准参

考物质。大肠杆菌
(E. coli)
细胞培养液。
Bacto YPD
发酵液。



1.2
色谱条件



色谱柱：
AminoPac PA10
分析柱（
2
×
250 mm
）
，
AminoPac PA10
保护柱（
2
×
50 mm
）
。



柱温：
30
℃（方法
1
）或
40
℃（方 法
2
）
。



进样体积：
10
μ
L
。



流速：
0.25 mL/min
（方法
1
）或
0.35 mL/min
（方法
2
）
。
。



淋洗液
A
：
water
；

淋洗液
B
：
250 mM
氢氧化钠；淋洗液
C
：
1 M
乙酸钠
；淋洗液
D
：
1 M
乙酸钠
+50 mM
氢氧化钠。



检测：积分脉冲安培检测器，氨基酸直接分析用金检测池，标准复合
pH- Ag/AgCl
参比
电极，
pH
参比电极。



方法
1
操作程序：流速
0.25 mL/min
，柱温
30
℃。



方法
1
操作程序：流速
0.35 mL/min
，柱温
40
℃。


ED40/ED50
电化学检测器的波形