法医DNA分析技术

2021年1月24日发(作者：毛纪)
第十六章法医
DNA
分析技术

第一节概论

1985
年英国遗传学家
Alec
Jeffreys
建立了
DNA
指纹技术，并成功的应用于一起移民案涉
及的亲子鉴定，开辟了法医物证
DN A
分析的新纪元，实现了法医物证鉴定从否定、排除到认
定的飞跃。法医
DNA
技术在短短的十几年里得到了飞速的发展和广泛的应用。特别是在
2000
年全国公安系统开 展打击拐卖妇女儿童专项斗争中，应用
DNA
分析技术进行了大量的亲子鉴
定。辨明了 被拐儿童的身份，使他们回到了亲生父母的身边和亲人团聚，从而使广大公安政法
人员及人民群众认识到 法医
DNA
分析技术的重要作用。

一，法医
DNA
分析研究的内容。

法医
DNA
分 析是应用现代
DNA
分析技术，
分析
DNA
遗传标记在群体中的分布 与传递规
律

。确定分析样品的一致性与遗传关系，为侦察破案和司法审判提供证据的 一门科学技术。
他涉及遗传学，分子遗传学，群体遗传学，生物化学，分子生物学和计算机学等多门学科 的交
叉和综合应用。

脱氧核糖核酸简称
DNA(deoxyribonucpeic acid )
是存在 于细胞中的遗传物质。它包含了机
体发育和功能所必需的全部信息。除同卵双生外，每个人的
D NA
碱基
(A
、

T
、

C
、

G)
序列
均不相同，是独一无二的。这些
D NA
序列上的差异有的在个人特征如眼睛、发色、肤色等表
现出来，更多的是不表现在个人的生 理外观特征上，必需用实验室特殊技术才能测定出来。法
医
DNA
分析就是应用特殊的 实验技术研究个体间的
DNA
差异及其遗传规律，
而服务于侦察破
案和司法审 判。
(
自
1985
年
DNA
指纹诞生以来，经过十几年的 发展，法医
DNA
分析已建立了
DNA
指纹
技术，
PCR< br>扩增片段长度多态性分析技术和线粒体
DNA
测序等三大主要技术，并在此基础上
发展了一些新的技术方法如
MVR
——
PCR
、
PCR
— —
SSOP
、
SSP
——
PCR
等共同形成了法医
DNA
分析技术。

二，法医
DNA
分析的对象





法医
DNA
分析的案件中主要涉及人体各种体液斑、 组织、毛发及表皮脱落细胞等。但是
在某些案件中已涉及到动物、植物及犯罪现场土壤中微生物的
DNA
分析。

三，法医
DNA
分析的任务。

法医
DNA
分析的主要任务是个人识别和亲子鉴定，
由于
DNA
遗传 标记的高识别率，
Y
染
色体遗传标记呈父系遗传，线粒体
DNA
呈母 系遗传，从而使亲子鉴定由过去一般遗传标记亲
子鉴定的有限范围得到较大的扩大，可以进行隔代、几代 甚至多代的亲子关系鉴定。

四，法医
DNA
分析的应用范围。
< br>法医
DNA
分析应用于所有涉及有细胞的生物物证的案件中。
(1)
凶 杀、
性犯罪、
恶性械斗。
(2)
犯罪现场无意中留下的指纹、毛发、唾液(
烟头、口香糖、面罩盗窃案使用的面罩等
)
。
(3)
碎
尸案尸源鉴定。
(4)
空难或突然性事件中尸源认定。交通事故中尸源及带有可疑血痕，组织 ，毛
发等肇事车的认定。
(5)
拐卖儿童、离婚、移民、入户、寻亲、遗产继承、计划 生育超生及医院
错抱婴儿的亲子鉴定。
(6)
器官移植，医疗纠纷中的个人识别与亲子 鉴定等。


五，法医
DNA
分析的特点。

DN A
遗传标记与传统的蛋白遗传标记相比有以下特点。
(1)
遗传标记多，信息量大。< br>(2)
标
记的遗传类型全，常染色体遗传标记按孟德尔规律遗传，
Y
染 色体的遗传标记呈父系遗传，线
粒体
DNA
呈母系遗传。
(3)
可分 析的物证种类多，存在广泛。凡是含有细胞的生物物证均能进
行
DNA
分析。
(4)DNA
在自然环境中具有较高的稳定性。
保存几十年的血痕，
精斑可进行
DNA
分析。
(5)
同一个体物证具有比对的通用性。
DNA
遗传 标记具有个体组织的同一性，可以用同
一个体的任何组织或体液均能得到该个体相同全部遗传信息。因此 进行比对和鉴定，不必采用
相同的组织。
(6)
方法灵敏，检材用量少。以
P CR
技术为基础的分析方法只需
ng
级
DNA
就可
获得检验 结果。
(7)
自动化程度高，速度快。
(8)
可以建立数据库，进行查档对比 ，检索破案。

六，法医
DNA
发展简史与进展

(
一
)
法医
DNA
发展简史






1944
年，
Oswald Avery
证 实了细胞成分
DNA(
脱氧核糖核酶
deoxyriibonucleic Acid )
为遗传
特征从上代向下一代传递的载体。
1953
年，
James Watson
和
Francis Crick
阐明了
DNA
分子结< br>构为双螺旋结构。
1980
年，
David Bostein
和同事首 先发现在遗传水平上人群间存在小的差异，
用
RFLP
技术检测这种差异。
1 984
年，
Alec
Jeffreys
在调查疾病的
DNA
遗传标记时，发现了
DNA
指纹图
(DNA fingerprint)
。
1985
年，首次进行一起移民涉及的亲子鉴定，
1986
年首次应用
于二起强奸杀人案。
1985
年，
Kary

Mullis
发明了多聚酶链反应
(polymerase chain React ion
，简
称为
PCR)
，同时
4
色荧光自动测序问世。< br>1990
年，
PCR
技术在法医学应用，第一个用
PCR
分< br>析的遗传标记为
HLADQ
α
。
1990
年，
Jef freys
报道小卫星
D1S8
基因座串联重复单位内部存在
差异，
1991
年报道用；
MVR
—
PCR
分析小卫星可变重复序列。1991
年，荧光标记复合扩增分
析
STR
基因座和应用
Che lex
—
100
方法提取
DNA
。
1992
年，开 始报道用毛细管电泳分析
STR
结果。
1993
年，
第一个商业STR
试剂盒面世，
PCR
同步扩增
Amelogenin
基因 座进行性别鉴定。
1996
年，多色荧光标记
STR
试剂盒向世，开始报道用
MALDI
—
TOF
分析
STR
扩增产物和线
粒体
DNA
基因芯片。
1997
年，开始大量报道
Y
—
STR
基因座。
1998
年，
2 000
个
SNP
杂交芯
片闻世。
1999
年，
Y
—
STR
得到比较 广泛的研究、应用。
2001
年，人类基因组计划框架初步完
成。

(
二
)
国内外进展

DNA
指纹技术问世后受到了 各国司法、
警察和法庭科学界的高度重视，
各国广泛研究和采
用
DNA
技术进行办案。欧洲各国初期广泛采用的主要是
DNA
纹印系统，北美除
DNA纹印系
统外，开发和应用了
HLADQa
和
Polymarker
等系统，现在世界各国广泛使用的是复合
STR
系
统，并进行
DNA
的直接测序分析
(
主要用于
mtDNA)
。

我国于1986
年开始法医
DNA
分析技术应用研究，
1988
年有研 究成果报道，
1989
年正式
应用于实际案件鉴定。
研究和应用的法医
DNA
分析主要有
DNA
指纹
(3
′
HVR
—< br>α
—珠蛋白探
针，
Myo
探针等
)
、
小卫星
(VNTR)
扩增片段长度多态性
(D1S80
，
APOB
等
)
、
微卫星
(STR
—
PCR)
复合扩增、数字 编码小卫星系统、线粒体
DNA
测序、
DNA
的性别鉴定。等等。现在广泛使 用
的是复合
STR
系统和
DNA
的直接测序分析
(
主要用于
mtDNA)
。

20
世纪末的微制造技术解放了集成电路 工业，
加快了计算机的速度和运行能力。
同样微制
造技术使
DNA
分 析中的样品制备和一些分析步骤微型化，设计一些仪器可以在犯罪现场进行
生物物证的分析，使
DNA
分析比传统实验室分析得更快、成本更低。目前在研究开发的主要
有以下三个微型化DNA
分析仪器：微芯片毛细管电泳装置
(microchip
capillary
electrophoresis
device)
、微型热循环仪
(miniature
thermal
cycler)
和杂交阵列
(hybridization
array)< br>。未来的法医
DNA
分析发展方向是微型化、智能化、网络化与全自动化，从
D NA
分析的结果中获得更多的
个体信息。

第二节检材的提取、保存与送检

DNA
分析检材的提取、保存与送检原则与 一般物证检验相同下面介绍常见检材的的提取、
保存与送检方法。


一、

常见检材的提取与保存

(
一
)
血液和血斑

1
．新鲜血液


(1)
新鲜血液由医务人员用无菌一次性的注射抽取
1-5ml
静 脉血液，加入
EDTA
二钠盐或枸缘酸钠抗凝放入试管中，充分混匀，加封。或者将抽取的血液 直接涂抹在无
菌纱布或干净滤纸上，
晾干制成血痕，
也可采集末梢血制成
1 cm
2
以上的血痕。
如果要进行
DNA
指纹分析，以液体血液送检 为最佳。
(2)
每个试管应标明日期、时间、嫌疑人的姓名、地点、采
血员的姓名、采 集的数量、案件名称编号和物证编号。
(3)
血液样品应置于
4
℃冰箱保存， 制成
血斑的，则在室温晾干，并应尽快送检。

2
．
现场的液体血


(1)
液体血应该使用干净 的
(
最好是灭菌的
)
注射器或一次性吸管，
将其吸
至洁的< br>(
最好是灭菌的
)
试管内。
(2)
凝血块可以使用清洁的药匙 将其移至清洁的试管内。
(3)
可以
使用清洁的纱布吸取液体血或凝血块制成血痕，< br>在包装和送往实验室前应晾干
(
禁止阳光直射
)
。
(4)标明样品案件名称编号、
物证编号、
日期、
时间、
采集物证的位置，以及物证采集员的姓名。

3
．
冰雪上和水中的液体血


(1)
冰雪上和水中发现的血液应立即提取，
以免被进一步稀释。
(2)
将那些最浓的样品尽可能地搜集到清洁、适合的容器内；采集时应尽可能避免杂质污染。

4
．衣服上的未干血斑


(1)
将带有未干血斑的衣 服放在一个清洁的表面晾干
(
避免阳光直
射
)
，不能用电吹风等热力 加速干燥
(2)
晾干后用干净的纸包装起来或装入纸袋内。
(3)
禁止抖动
带血斑的衣服，以防引起血痂的脱落。

5
．物品上的未干血斑


(1)
带有未干血斑的小件物品应晾干后整件收集并包装。
(2)
对于不
宜从现场移出的大件物品存在的未干血斑，将其转移到干净的棉纱布上晾干后装入纸袋内。

6
．大的或不可移动物品上的干血斑，如墙壁或混凝土上的干血斑


(1)
对血斑的形状必须
做记录、照相并且画图。
(2)
用蒸馏水 湿润清洁的纱布或拭子将血斑样品擦拭转移下来或将血
斑直接刮到一张清洁的纸上；或用高粘质胶带将每 一个斑点从其所在的物体表面上粘下来；或
用一个小吸管吸少量蒸馏水置于斑痕上，反复吸排多次，将斑 点从物体上洗下来，然后将样品
吸到一个清洁的试管内。
(3)
转移到纱布或拭子的血 要晾干，
再将其放在专门的纸袋。
(4)
每一件
物证都要收集没有斑痕的部分 ，作为“基质对照”送验

7
．可以切割的物体，如地毯或室内装潢材料上的干血斑


(1)
详细记录、照相斑点情况。
(2)
用一个清洁的刃器将带有血斑部分的物证材料切割下 来。
(3)
对每个切割下来的物证都应该分
别包装和标记。

8．小的飞溅的血点常常很难从物体的表面上转移下来。在做了适当的记录以后，可以用
胶带或湿润的 消毒棉纱线将样品提取下来，应避免从周围区域提取污染物。

9
．交通肇事案件中汽车上的血斑


(1)
全面检查汽车 的外表面，确定有无毛发、组织、血
液、以及其他的痕迹物证。所有的检查发现都要一一记录。发现血斑 用湿纱布转移提取血斑，
然后晾干包装。
(2)
如需要进行指纹显现，宜用对
DNA
检验无害的显现方法，如铝粉法显现指
纹。否则应在显现指纹前提取血斑。

10
．尸体上的血斑


(1)
尸体上的血斑在提取前应仔 细记录。
(2)
应注意血斑的位置；大小、
数量、形状和类型。
(3)
由于尸体上血斑易于脱落，因此在移走尸体以前将血斑提取下来。
(4)
在收集尸体上的血斑 时，为了减少附带尸体本身的皮肤细胞，应尽可能轻轻地将斑点取下。如
使用湿纱布轻轻地擦拭斑痕。< br>(5)
指甲下的血斑应该使用清洁的牙签刮下。用清洁的指甲剪将指
甲剪下并收集起来。 尽量不要带死者本人的血液和组织。每个指甲和牙签均应分开包装。

（二）精液和精斑

1
．现场上发现的液体精液物证

< br>(1)
精液物证应该照相、录像和画图记录。
(2)
用一个清洁
的注射 器或一次性吸管将液体精液吸至一个灭菌的试管内保存在冰箱内。
(3)
也可将液体精液吸取到干净的纱布或棉球上。然后晾干、包装、加封和标记。

2
．可移动物体上精斑


(1)
裤子、衣服、床单、枕头 、纸张，以及其他可移动物体上的精
斑整件进行收集。
(2)
如果物品上的斑痕是湿的 ，
在收集包装以前必须将其彻底晾干。
(3)
每一件
物证都必须单独包装，并 做好标记。

3
．可以切割的大的物体上的精斑


(1)
大的物体，如地毯、床垫、室内装潢材料上的可疑
精斑可以将其切割下来。
(2)分别包装并做好记录。

4
．不可移动的、非吸湿性物体表面上的精斑
( 1)
不可移动的具有非吸湿性表面的物体，如
地板、柜台、金属表面的样品等。
(2)
提取精斑前必须做好采证记录。
(3)
用干净的解剖刀将精斑
刮到干净纸上，
然后将其折叠包起来。
也可以用胶带粘下来或用棉球拭子将斑痕擦拭下来晾干。
(4)
分别包装并标记。

5
．从性犯罪案件受害者身上提取精液


(1)
性犯罪案件受害者的物证的采集应在医院、门
诊室进行。
( 2)
根据被强暴案情，用无菌纱布或棉球擦拭阴道、口腔
(
口交案例
)
和肛门
(
鸡奸
)
。
纱布或棉球的面积千万不要过大，否则因擦拭物 面积过大，精液斑不集中，影响下一步检验。
提取的擦拭物要晾干保存。

(
三
)
组织、器官和骨骼

1
．新鲜组织、器官和骨骼


(1)
每件物证都要采用各 种方法进行描述，包括笔录、照相或
录像做采证记录。
(2)
每个物证都要使用一个清 洁的器械进行收集。所使用的镊子在使用之中，
要彻底地进行清洗。对腐败尸体，要取深层肌肉或肋软骨 。放在一个清洁的可固定的容器内。
(3)
密封后，做好标记并放冰箱冷冻保存。

2
．陈旧组织、器官和骨骼


(1)
在收集前应该对每个 物证进行拍照和画图。详细记录大小、
形状、类型及其和其它物证相互之间的空间关系。
(2)
每个物证都应使用清洁的镊子提取。对仍
然连在一起的物证应该一块儿提取。收集时不应将其分 开。
(3)
骨骼尽量提取长骨，而且不要人
为地将长骨切成两截。否则，骨内
DNA
容易被污染。

(
四
)
唾液、尿液和其他体液

1
．液体样品


(1)
液体的唾液或尿应尽快装入一个清 洁的消毒的容器内
(
试管或烧杯
)
。
(2)
每个容器上都要 加封并做好标记冷藏保存。

2
．斑迹


(1)
唾液斑、尿斑和其他体液斑可以整件物证收集，也可以将其从载体上刮下或
剪切下，予以收集。
(2)
物证必须彻底干燥并且放入纸袋内。刮削物和剪切物应收集在一张清洁
的纸上并折叠包好 。然后再将其放人第二个纸包装袋内，加封并做好标记。

(
五
)
毛发

(1)
用清洁的镊子夹取毛发。(2)
不在一起的毛发应分别搜集、包装，做好标记。
(3)
在收集
过程 中必须小心操作，不要损坏可能存有的毛根组织。
(4)
与血液、组织、或其他体液混合存在< br>的毛发，提取时应小心处理。每个物证都要单独包装，并做好标记。
(5)
如果毛发与体 液混在一
起，应晾干后包装送检。

(
六
)
强奸致孕案件的检材


受害人被强奸致孕 ，如果已人工引产，可用干净无菌的手术刀切开胎儿颅骨，用干净无
菌的药勺或滴管取引产胎儿脑组织，
放人干净试管或烧杯内，
或取胎儿肌肉，
登记受害人姓名、
采集时间、地点和 采集人等，密封，冷冻保存，送检。如未人工流产
(
怀孕
3
个以内
)
可在医院
采集绒毛。如要人工流产，一定在流产前告知医院妇科彻底清洗吸引器，不能留有其他 人的组
织，而且吸引时不能将胚胎弄得太碎，以免分不清是胚胎还是母体组织。

二、检材的送检

提取的检材要尽快送往实验室进行检验。在送检现场提取检材的同时 ，采集与案件有关人
员的样品并一同送检。有关人员的样品一般均采集其血液，或制成血痕，血液采集方 法同前。
在送往实验室的过程中也要注意避免检材
DNA
发生降解，为此在送检过程中 要尽量避免检材
经受高温、高湿、日光照射以及过长的运输时间，鲜血要求放在冰壶中送检。不同案件需 要收
集的有关人员样本如下。

1
．现场物证为精斑的案件：要求采集受害人 、有关犯罪嫌疑人的血液
(
痕
)
；如果精斑的载
体上有可能留有其他 人的精斑如受害人丈夫等，必须采集他们的血液
(
痕
)
一同送检。

2
．强奸致孕的亲子鉴定案件：采集受害人血液、受害人所怀胎儿组织或绒毛
(
未人工流产
)
与有关嫌疑人血液。

3
．确定身源的亲子鉴定案件 ：除现场检材外，还需采集嫌疑父母血液、或妻儿
(
或丈夫和
孩子
)
，如因某种原因不能采集到其嫌疑父母血液、或妻儿
(
或丈夫和孩子
)
样品， 可采集嫌疑人
的同胞血液，并尽可能多地采集所有同胞血液，或同一父系的或同一母系的亲属血液送检。

4
．个体识别类的案件：现场检材以及比对样品，如嫌疑人、受害人血等。

第三节检材的
DNA
提取

DNA
存在于细胞内，在进行< br>DNA
检验前，需将
DNA
从细胞中提取出来将其与细胞其他
成份分开 。现场提取的检材如血痕、精斑等常留于各种载体上也需将其分开。目前
DNA
提取
常 用方法有
(1)
有机提取法
(
经典的饱和酚
-
氯仿法
)
(2)Chelex-100
提取法
(3)
无机提取法
(4)
其他提
取方法如磁性珠提取法、硅珠提取法、碱裂解法等。

一、

常见检材的
DNA
提取

(
一
)
有机提取法提取各类检材
DNA
1
．血液


(1)3ml EDTA
—抗凝血，加入等体 积裂解液，剧烈振荡，使细胞裂解，溶液呈透
亮状。
(2)3 000-5 000r
／
min
离心
15min
，去掉上清液，收集沉淀，用
3ml
生理盐水洗净沉淀，
3 000-5 000r
／
min
下离心
1 5min
，收集沉淀，如果此时沉淀仍带有红色，再反复用生理盐水洗
沉淀，直至沉淀呈无色。
(3)
加入
1.5mlEDTA
—
Na2
提取液，悬浮沉淀 ，并反复吹打，使沉淀分
散开来。
(4)
加入
1
／
10体积
10
％
SDS
，使其最终浓度为
1
％混匀。
(5)
加入
1
／
20
体积
2mg
／
ml
PK
(
最终浓度
100
μ
g
／
ml)< br>，混匀，封口，置于
37
℃保温
4h
。
(6)
向溶液 加入等体积的饱和
酚，以上下反复颠倒试管混匀液体，将试管内溶液混合成乳状液。
3
000
～
5
000r
／
min
下离心
5 min
，此时溶液分成三层，
DNA
在无色的上层水相中，中间白色混浊层为变性蛋白 质。最下
层带褐或黄色的是酚。
(7)
转移上层水相到一干净试管中。为增加
DNA
回收量，可以在有机相
中加入等体积
TE
溶液
(pH7
．
8)
，充分混匀后，离心，吸取上层水相，与第一次抽提的水相合
并。
( 8)
加入
1
／
2
体积的饱和酚和
1
／
2< br>体积的氯仿—异戊醇（
24
：
1
）
，混匀。
3000
—
5000r
／
min
离心
5min
。如果水相层 和有机层的界面不甚清楚，说明其中含蛋白质较高，可采用多次酚
／氯仿抽提，并可适当加大离心速度和 或延长离心时间。
(9)
转移上层水相到另一干净试管中，
加入等体积的氯仿—异戊醇 混匀，
3 000-5 000r
／
min
离心
5min
。
(10)
转移上层水相到另一干净
管中，加入
1
／
10体积的
3mol
／
LNaCl
轻轻混匀，加入
2
．5
倍溶液体积的冰冷
(-20
℃保存的
)
无水乙醇，混匀，沉淀
DNA
。
(11)10000r
／
min
离心
5m in
，收集沉淀，用
70
％乙醇洗去
DNA
中的盐，
5 0 00r
／
min
离心
5min
，
除去液体，
真空抽 干
DNA 5min
，
使
DNA
成无色透明状。
(12)< br>加适量
(50
—
100u1)TE
缓冲液溶解
DNA
，溶解后的
DNA
溶液于
4
℃保存。

2
．血斑


(1)
将血斑剪碎，加入适量
TNE
浸泡底物，
TNE
的体积以底物全部浸湿，底物表
面还保留
1-2m m
左右高度的
TNE
溶液层为宜，加入
1
／
10
体 积的
10
％
SDS
和
1
／
20
体积的PK(2mg
／
m1)
使终浓度分别为
1
％和
100u g
／
ml
，
37
℃保温
3
小时。
(2)< br>用套管法离心
(5
000r
／
min
离心
5min )
除去载体底物。也可以不用除去载体，直接加酚抽提。
(3)
收集溶液，用酚—氯< br>仿抽提，以下步骤同血液
(6)

—


(12)
。

3
．精液与精斑


(1)
取
0
．
5ml
精液加入等体积生理盐水，洗涤
2-3
次，
3
000r
／
min
离心
5min
，收集 沉淀物，加入精子
DNA
提取液和蛋白酶
K(
终浓度为
100ug< br>／
m1)
混匀，于
37
℃水
浴保温消化
3h
。

DNA
提取及溶解过程同血液
(6)
—


(12)
。
(2)
从精斑中提取
DNA
：方法基
本同血斑将消化血斑用
TNE
改为精子提取液。

4
．从精液和阴道分泌液混合斑中提取精子
DNA
（差异消化法）


(1)
精子检查：取少许检
材经染色，于显微镜下观察，确认精子的存在。
(2)
将带有精子的检材剪碎，装入
1
．
5ml
离心
管中，加
lml TNE
于
37
℃浸泡
30rain
。然 后加入
1
／
10
体积的
10
％
SDS
至终 浓度为
1
％，加蛋
白酶
K
至终浓度
40
μ
g
／
ml
，于
37
℃保温
2h
消化上皮细胞。对于 那些需要对女性阴道上皮细
胞进行鉴定的检材，加
TNE
后先在
37~C保温
1-2h
，通过离心收集细胞，使女性上皮细胞和精
子等细胞先与载体分离开 来，此时不要加
SDS
和
PK
。然后在收集的细胞中加
SDS
和
PK
进行
分步提取。
(3)
将消化后的混合物用套管法离心去载 体，
3 000-5 000r
／
min
离心
15rain
，收集流
出液中的沉淀物。
(4)
用
TNE
洗沉淀物，
3
000
—
5000r
／
min
离心
15min，重复此步骤一次，收
集沉淀物。
(5)
向沉淀物中加入精子提取液和蛋白酶K
，终体积为
300
μ
l
，
PK
终浓度为100ug
／
m1
，于
37
℃水浴中消化
3h
。
(6)DNA
抽提步骤同血液
DNA
提取
(6)
—
(12)
。

5
．人体有核细胞组织

取组织约
0.1g
，用生理盐水洗净附着的血液后将检材剪碎，加入
DNA
提取缓冲液，用匀浆 器研磨，再加入蛋白酶
K(
终浓度
200
μ
g
／
m 1)
和
1
／
10
体积的
10
％
SDS，于
37
℃消化
3h
。随后
DNA
提取步骤同血液(6)
—
(12)
。



6
．唾液
(
斑
)

同血液
(
斑
)
。



(
二
) Chelex
—
100
法提取微量检材
DNA
1
．
血液
(1)
取
lO
—
50
μlEDTA
抗凝血加到
0
．
5ml
离心管中，
再加入< br>500
μ
l
灭菌蒸馏水
,
剧烈振荡，室温下放置
15 min
。
(2)13 000r
／
min
下离心
3min< br>去上清液，收集沉淀，反复用无
菌蒸馏水洗净白细胞沉淀物，直至无色或血色素很少。
(3)
加入
200
μ
l 5
％
Chelex-100
溶液，
置
56
℃保温
30
—
60min
，
振荡
8s
，
100
℃保温
8min
后，
剧烈振荡
8s
，
10000r
／
min
下离心
3min，
上清液可用于
PCR
反应或者
4
℃保存。

2
．血斑
(1)
取
0.2
—
0.5cm
2的血痕放入
0.5ml
离心管中，加入
500ul
无菌蒸馏水，剧烈振荡，室温下放置
15min
。
(2)13 000r
／
min
下离心
3min
，去上清液，收集沉淀，载体不需要
去除，始终留在离心管内 。
(3)
同血液
(3)
。

3
．
精液和阴道分泌液混合斑


按有机提取法中精液和阴道分泌液 混合斑提取
DNA
方法解
分离理除去混合斑中上皮细胞，
干净的精子沉淀物用
200
μ
l 5
％
Chelex-100
溶液悬浮，加
DTT
和
PK
至终浓度分别为
39mmol
／
L
和
100
μ
g
／
ml
，
在旋涡振荡器 上振荡
7
秒钟，
56
℃保温过夜，
振荡
7
秒钟，< br>100
℃保温
8min
后，
剧烈振荡
7
秒钟，
10000r
／
min
下离心
3min
，
上清液用于PCR
反应或
4
℃保存。

4
．唾液
(
斑
)
唾液
(
斑
)
样品的
Chelex
法处理同血液（斑）
。

5
．毛根

剪取毛发的毛根部分
5
—
10mm< br>，置于
1.5ml
离心管中，加入
200
μ
l 5
％
Chelex-100 2
μ
1 10mg
／
ml
蛋白酶
K
，
56
℃保温过夜
(
至少
6h)
，剧烈振荡
5
—
10s
，沸水
煮
8min< br>振荡
5
—
10s
，
10000r
／
min< br>离心
2
—
3min
，取上清液用于扩增反应。

6
．其他有核组织

取冷冻组织少许，研碎，用生理盐水洗去附着在组织上的血，
5 000r
／
min
离心
5min
，去上清液；用
200
μ
l 5
％
Chelex-100
悬浮沉淀，加
2
μ
1 10m g
／
ml
蛋白
酶
K
，
56
℃保温过夜(
至少
3h)
，剧烈振荡
5-10s
，沸水煮
8min
，再剧烈振荡
5
—
10s
，
10000r
／
min
离心
2-3min
，取上清液用于
PCR
扩增反应。

7
．羊水

取
500
μ
l
羊水，
15 000r
／
m in
离心
3min
，弃上清，加入
200
μ
l 10
％
Chelex
—
100
和
2
μ
l 10mg
／
ml
蛋白酶
K
，混匀；
56
℃保温30min
；高速振荡
5-10s,
沸水煮
8min
，高
速振荡
5
—
10s
，
10000r
／
min离心
2-3min
，取上清液用于
PCR
扩增反应。

二、
DNA
的贮存


在适宜条件
(
如
TE
，
pH8.0)
下，纯净的
DNA
能长期贮存而无明显 降解。
DNA
一般溶于
TE
溶
液，
4
℃保存。在< br>pH8.0
下，
DNA
的脱氨基速度比在中性时慢。
TE
溶液 中的
EDTA
螯合二价阳离
子，抑制
DNA
酶的活性，防止
DNA
降解。因为二价阳离子是大多数核酸酶的激活剂，而核酸酶
又恰是降解
DNA< br>的主要因素。
EDTA
还能抑制微生物生长，从而抑制核酸酶的形成。通常，在贮
存
DNA
的溶液中加一滴氯仿，防止霉菌生长。将
DNA
在上述缓冲液中冰 冻贮存时，产生缺口的
速度更慢；但解冻时又可产生新缺口，因此不宜反复冻融，不宜使用自动除霜的低 温冰箱贮存
DNA
。
Chelex
—
100
提取的
DNA
溶液应于
4
℃保存，对于长期保存的，最好将上清液转移到一干
净离心 管中，除去
Chelex
—
100
颗粒，置于
-20
℃下保 存。

第三节
DNA
分型基础

一、
DNA
的分子结构





DNA
是由
4
种核苷酸组成的多聚体。
4
种核苷酸的不同之处在于 与脱氧核糖共价结合的含
氮碱基类型。碱基分两大类；嘌呤类及嘧啶类碱基。嘌呤类碱基有：腺嘌呤(A)
和鸟嘌呤
(G)
；
嘧啶类碱基有：胞嘧啶
(C)
和胸腺嘧啶
(T)
。
DNA
分子结构中的核苷酸通过磷酸二酯键将一个核苷酸脱氧核糖的
5
′位碳与前一个核苷酸糖的
3
′位碳共价结合。
4
种不同的碱基则沿磷酸脱氧
核糖结合形成的骨架以任意次序与脱氧核糖结合，几十万个核苷 酸聚合成一条
DNA
长链，链
上有无数不同核苷酸序列的排列方式。细胞核的
DNA
由两段多聚核苷酸链组成，它们形成一
种很特殊的双股螺旋状分子。两股链之间由各股链 特有的碱基以碱基配对原则形成氢键而连
接：
A
只能与
T
形成氢键；
G
只能与
C
形成氢键，
A-T
，
G-C
结 合后形成碱基对
(bp)
。互补碱
基配对原则是所有
DNA
分析方法 的最基本原理。

将
DNA
加热至
80
℃以上或在碱性环境 下，
DNA
分子中的氢链断开，
产生
2
条多核苷酸单
链的过 程称为变性
(denaturation)
。
当缓慢冷却至室温，
或将碱性溶 液中和，
2
条单链重新按互补
原则配对结合，形成原来双链的过程称为退火或复性(annealing)
。

二、结构基因

人类有
4 6
条染色体，
各包含有一个
DNA
分子，
每一个体细胞内的双倍体基 因组含
6
×
10
9
个核苷酸。基因是
DNA
分子上 的一个具有特定序列的片段。结构基因是决定某一种蛋白质分
子结构的一段
DNA
或染 色体，由前导序列、外显子、内含子及尾随序列组成。
5
′端和
3
′端
均有侧翼序列。编码部分为外显子，非编码部分为内含子。内含子长度为
40bp
～
1kb
，比外显
子长。编码部分大多数是单拷贝序列，高度保守；非编码部分则有单拷贝和多拷 贝
DNA
序列
之分。多拷贝序列又称重复序列，变异很大。基因组中编码的
D NA
占极少数，约
1
％～
3
％，
非编码
DNA占
97
％～
99
％。人类约有
10000
个结构基因被 大量非编码的
DNA
不均一地穿插
其间。

三、
DNA
多态性类型

DNA
碱基序列变异称为
DNA
多态性
(DNA
poly morphism)
，按孟德尔定律遗传。
DNA
多
态性可分为序列多态性及 限制性片段长度多态性两大类。

(
一
)
序列多态性

序列多态性
(sequence polymorphism)
指某位点碱基排列的个 体差异，
例如
HLADQ
α
多态位
点，在相同
242bp< br>的扩增片段上，某些局部的碱基序列变异，形成了多个等位基因，用探针
(
指
已 标记的，与目的
DNA
碱基序列互补的单链
DNA
或
RNA
片段
)
杂交，测出
4
个主要基因：
DQAl
、
2< br>、
3
、
4
。
DQAl
和
DQA4
各 有
3
个亚型：
DQAl.1
；
1. 2
；
1.3< br>和
DQA4.1
；
4.2
；
4.3
，故
DQ A
基因碱基序列变异区段共有
8
个等位基因。
人类线粒体
DNA在个体间有明显的序列差异，
这些差异存在于线粒体
D
环区附近，可用
D NA
测序方法测定。

(
二
)
限制性片段长度多态性

限制性内切酶
(restriction endonuclease
，
RE )
简称限制酶，
这是一类能识别
DNA
分子内特殊
序列的酶，
能特异地与
DNA
识别序列内或其附近的特殊位点结合，
将双股
DNA切割。
限制性
片段长度多态性
(restriction fragment length polymorphisms RFLP)
是指
DNA
限制酶识别序列 核苷
酸结构发生改变，导致酶切位点产生、消失或移位，酶切所产生的限制性片段数目及长度发生
改变所呈现的
DNA
多态现象。产生限制性片段长度多态性的分子结构基础有下列
3
种类型。

1
．点突变


点突变是指
D NA
序列中限制性内切酶识别位点发生单个碱基替换或修饰，使
识别位点丢失或获得，以致限制 性片段大小或数目发生改变，又称单碱基突变
(single
base
chang e)
。点突变包括碱基置换突变、移码突变及回复突变
3
种。一个碱基被另一个碱基所 取代
的点突变属于碱基置换点突变。镰状红细胞贫血的发生，是因与其基因相关的
β
珠 蛋白基因发
生了点突变的结果。编码正常血红蛋白分子的核苷酸序列是
5
′—
CCTG(A
)
GGAG
，而编码镰
状细胞贫血患者血红蛋白分子的核苷酸序 列是
5
′—
CCTG(T)GGAG
，编码谷氨酸的密码子
GAG< br>发生点突变，成为编码缬氨酸的
GTG
，即单一碱基
A
被单一碱基T
置换，导致形成限制
片段长度多态性
(restriction
fragment
lengthpolymorphism
，
RFLP)< br>。这种点突变可用限制性内切
酶
Mst
Ⅱ检出，编码正常血红蛋白的基因显示两 条谱带：一为
1.1kb
；另一为
o.2kb
。镰状细胞
贫血患者由 于发生了点突变，原切割点消失，所以只显示一条谱带，大小为
1.3kb
。这是一个
典型的点突变例子，也是第一个报道的人类
DNA
点突变的
RFLP
。

在分析过的所有人类基因或基因附近均观察到这种类型的
RFLP
，只有那些影响 限制酶识
别位置的变异，
才能测出
RFLP
；
只有用同一限制酶切割 的
DNA
在探针识别的区段内发生点突
变才能测出
RFLP
。
这种类型的
DNA
序列多态性只有
2
或
3
种等位基因，< br>法医学应用价值有限，
但遗传疾病诊断方面却很重要。

2
．片段插入与缺失


在探针识别的限制性片段内有一段
DNA
插入或缺失，会导致酶切割
点的增多或消失，导致限制性片段大小发生改变。以
C4 cDNA
′片段为探针，以
Hind
Ⅲ酶解
基因组
DNA< br>，
对
C4
基因进行
RFLP
分析时，
单倍型基因C4A
﹡
C4B(L)
可检出
32kb
和
15kb两
条谱带，而在部分缺失的单倍型基因则只能检测到一条
8.5kb
的谱带。
3
．重复序列数目的变异


以多拷贝形式存在的
DNA
序列称重复序列
(repetitive seq uence)
。
人类整个基因组内重复序列约占
20
％～
30
％，它们大多存在于基因内非编码区
(
如内含子
)
或基
因附近。重 复序列的命名与分类主要依据其结构和分布特点。

DNA
重复序列


散在重复序














串联重复序
















倒位重复序


短片断


长片断



经典卫星
DNA


中卫星
DNA




有间隔




无间隔

间隔型


间隔型



(
大卫星
DNA)



小卫星
DNA




倒位重




倒位重

卫星
I





微卫星
DNA




复序列




复序列

卫星Ⅱ

卫星Ⅱ

卫星Ⅳ

α
卫星












表
16
—
1

DNA
重复序列分类
< br>DNA
重复序列可分为散在重复序列、串联重复序列及倒位重复序列
3
类
(
表
16
—
1)
。倒位
重复序列
(invert ed
repeats)
是一类特殊的重复序列，重复单位间是互补序列，在同一条
D NA
链
上呈反向排列。倒位重复序列有
2
种形式：一种是两个互补拷贝之间隔 着一段间隔序列；另一
种倒位重复序列是
2
个互补拷贝串联在一起，中间无间隔序列， 呈迥文结构
(palindrome)
。
180'
旋转对称。人类基因组中大 约
5
％为倒位重复序列。复重复序列的组成、分布、拷贝数目及长
度是极其多样的。重 复序列单元所在位置称基因座，按孟德尔定律遗传。

(1)
散在重复序列：
单拷贝
DNA
序列以其单体出现在不同染色体或相同染色体的不同位置，
称为散在重复 序列
DNA(interspersed
repetitive
segment)
。因其间隔片段大小不同又分为短片段
间隔型
(short interspersed segment SINEs)
和长片段间隔型
(long interspersed segment
，
LINEs)
。

①
SINEs
：一般说来，
SINEs
包含＞
500bp
长的
DNA
序列。灵长类中最显著的
SINEs
是
Alu
家族， 这个家族包含近
300bp
的一个重复单元
(
或称重复子，
repe ats)
，含有一个
AluI
限制
酶切点。人类每个单倍体基因组
A lu
序列的拷贝数估计有
300
万～
910
万，所以人类基因组中< br>Alu
家族占
3
％～
9
％。其他灵长类只有很少的
A lu
序列拷贝。

②
LINEs
：在研究过的种属中，仅有一个LINEs
家族。人类的
LINEs
家族就是
LIHs(
或称< br>Kpn)
家族。
LINEs
重复子
DNA
序列长约
6
～
7kb
，有些成员片段长度大于
7kb
，最短的片段为
o .5kb
。
这些短片段家族成员多数失去
5
′端片段。
据估计
,
人类基因组中
LINEs
的拷贝数目高达
107 000
。有证 据证明，
LINEs
主要存在于染色体
G
／
Q
带，与
Alu
家族序列最初定位于
R
带不
同。
G
／
Q< br>带富含
AT
，是迟复制
DNA
的代表，能被
Giemsaqu inacrine
染料着色。

(2)
串联重复序列：
多个特定序列 首尾相连组成的重复序列称串联重复序列
（
andem repeats
）
，
又称卫星
DNA(satellite
DNA)
，分成
4
类；①经典卫星
DNA(classical
DNA)
，又称大卫星
DNA(macrosatellite
DNA)
；②小卫星
DNA(minisatellite
DNA)
；③微卫星
DNA(microsatellite
DNA)
；④中卫星
DNA(midsatellite DNA)
。大卫星
DNA
及中卫星
DNA
因多态性相对简单，在
法医学上应用极少，< br>小卫星
DNA
及微卫星
DNA
则因具有极高的多态性，
是法医 学研究和应用
的重点。





①可变数串联重 复序列
(
小卫星
DNA)
多态性：可变数串联重复序列
(varia ble
number
oftandem repeats
，
VNTR)< br>，
Wyman
和
White
最初发现时，因其具有高度多态性，称之为 高变区
(hypervariable
region)
。
VNTR
是由许多长度为
6
～
70bp
的串联重复子组成的
DNA
序 列，重复
的数目少至数次，多至数千次，所以这种序列的长度变异很大，即有长度多态性。
α< br>-
球蛋白基
因附近的一个由
17bp
组成的
DNA
序 列，它们在人类基因组中重复的数目可以少至
70
次，也
可以多至
450次，故这个区域的碱基对的总数变异在
1190(17
×
70)
至
7650(17
×
450)bp
的范围，
说明
VNTR
的 长度变异是很大的。
VNTR
多态性结构基础在于不同个体高变区所包含的串联重
复序 列拷贝的差异，高变区两侧内切酶识别切点的位置随高变区的大小而发生相对位移的结
果，而限制酶识别 切点本身的碱基未发生改变，限制酶也不切割
VNTR
区的内部。

这类串联 重复
DNA
不仅出现在单一基因座上，也出现在多个基因座上。当不同基因座上
的小卫 星所有重复序列都含有一段相似的，约
10
～
15bp
长的保守顺序，即核心 序列
(core
sequence)
时，一个含有多拷贝核心序列的多基因座
DNA
探针，在低强度杂交条件下，可同时
检出许多
VNTR
基因座，获得由一系列复杂的高度变异的
DNA
片段谱带组成的图像，
即
DNA< br>指纹图。

②短串联重复序列（微卫星
DNA
）多态性：短串联重复
(short
tandem
repeats

STR)
的重
复序列短 ，
仅
2
～
7bp
，
是一类简单重复
DNA
，
也是一种
VNTR
。
STR
串联重复
10
～60
次左右，
所以又称为微卫星
DNA
。
STR
中最常 见的是二聚核苷酸重复单位。
STR
与
VNTR
同样都是串
联重复< br>DNA
序列，具有极高的多态性，亦按孟德尔定律遗传。
STR
分布广，散布在 整个基因
组中，
平均每
10kb
就有一个
STR
基因座，< br>在人类基因组中约存在着
5
万～
10
万个
STR
串联 重
复序列。

(
三
)
线粒体
DNA
多态性




绝大部分
(98
％
)DNA
存在于细胞核内的染色质中，
只有极少部分
DNA
存在于核外线粒体
中。线粒体
DNA(mito chondrial DNA
，
mtDNA)
与核基因组
DNA
的构 型不同，虽然都是双股结
构，
但却呈环形，
不为组蛋白所结合而裸露，
全长< br>16569bp
，
每个细胞内有几百至几千个
mtDNA
拷贝，均为单 倍体。线粒体基因组约有
5
％～
7
％的
D
—环区
( displacement loop)
，
D
—环区表现
极大的结构多态性，属于序列多态性。

四、

DNA
遗传标记的命名

DNA
遗传标记的 命名，国际上有统一的标准。对于是基因的一部分或位于基因内部的标
记，用该基因的名字命名。例如< br>STR
标记，
TH01
是位于
11
号染色体上的酪氨酸羟化酶 基因，
TH01
中的“
01
”意味着所涉及的重复区定位于酪氨酸羟化酶基因 第
1
个内含子。有时在基因
座名字前加一个前缀“
HUM'
’
，这表示来自于人基因组，因此
STR
基因座
TH01
正确地表示为
HUMTH01
。
对于基因区外的
DNA
标记，
以他们所在的染色 体位置命名。
例如，
D6S366
和
DYSl9
。
它们不在 编码区。这里“
D
”代表
DNA
，
D
后的数字代表染色体的 编号，
6
指
6
号染色体，
Y
指
Y
染色体。
“
S
”指的是
DNA
标记为单拷贝序列，最后的数字代表该标记发现 的顺序和特定
染色体的分类。用有序数目来命名每个
DNA
标记，使每个
DN A
标记独一无二，不会重复。例
如，
D18S51
标记的每个符号表示：D
：
DNA
，
18
：
18
号染色体，
S
：单拷贝序列，
51
：
18
号
染色体第
51个基因座。

五、核酸的限制性内切酶

限制性内切酶简称限制酶，是一 类能识别双链
DNA
中特定核苷酸序列的核酸水解酶，以
内切方式水解
DNA
链中的磷酸二酯键，产生
DNA
片段的
5
′端为
P
，
3
′端为
-OH
，这类酶都
是从原核生物中发现的。原核生物自身 的
DNA
并不受限制酶水解，因为宿主细胞内同时存在
与相应限制酶识别序列相同的甲 基化酶，使内源
DNA
中的识别序列以甲基化形式被修饰，不
被原核生物内的限制酶消 化。
1970
年，
Smith
等首次发现限制酶
Hind
Ⅱ ，到
1985
年已从
350
多种微生物中发现了
498
种限 制酶，识别
108
种特定核苷酸序列。

制备
DNA
指纹图 选择限制酶有
3
个基本条件：①限制酶识别点应位于
VNTR
位点的侧翼序列，要求尽可能靠近串联重复单位的
5
′端和
3
′端；②酶特异性和酶 活性稳定，不易受酶
切反应条件变化的影响；⑧不受基因组
DNA
中的甲基化修饰的影 响，
DNA
指纹技术中最常用
的限制酶有
Hae
Ⅲ、
Hin fI
和
Pst I
。

六、探




针

生物学意义的探针
(probe)
是指能与特定靶< br>DNA
分子发生特异性作用、并能被特定方法探
知的分子。
DNA
指纹 技术应用的核酸分子探针是指经示踪物
(
即标记物
)
标记的、能与互补靶核< br>酸序列实现退火杂交的已知核苷酸片段。核酸分子探针可分为基因组
DNA
探针、
eDNA
探针、
RNA
探针和人工合成的寡核苷酸探针等。
DNA
指纹检测多用基因组
DNA
探针，
另有一部分是
参照
VNTR
位点的核心序列由人工合成。
制备
DNA
指纹图时选择探针与选择限制酶同样重要，
探针选择的基本原则是探针必须具备高度特异性，探针制备与标记容易，以及探针的杂交必须
稳 定等因素。最常用的探针是从基因组
DNA
中筛选的小卫星探针，它们应有共同的碱基组成，< br>是小卫星
DNA
核心序列重复串联形成的多聚体。按分子杂交要求的条件以及检测的VNTR
位
点数不同，小卫星探针又可分为多位点探针和单位点探针分别用于
DN A
指纹与
DNA
纹印。





七、分子杂交



分子杂交
(molecular hybridization)
是指来源于不同
DNA
分子的两条非同源
DNA
单链，因
部分碱基互补，在退火条件下，局部碱基配对，结合形成一条双链核酸的过程。 分子杂交一词
常与退火互换应用，但分子杂交主要用于鉴定两条来源不同的聚核苷酸链上碱基顺序的同一 性
问题，而退火则指两条互补的
DNA
链变性分离后，在适当的条件下又重新结合，或 双股
DNA
链变性分离成单链后，
与人工合成的互补链
(
引物
)
结合，
形成双股
DNA
新链。
一般进行分子杂
交时，在 一定的温度和一定的盐浓度条件下，至少其中一个单股链
(
探针或靶序列
)
处 于游离状
态。
在较低温度和较高盐浓度条件下进行杂交，
谓之低强度杂交
(l esser stringency)
，
常用在两股
链紧密相关但又略有不同序列的分 子杂交，两股链互补结合，形成稳定的双股链，低强度杂交
多用于多基因座探针杂交。在较高温度
(65
℃
)
和较低盐浓度条件下进行分子杂交，谓之高强度
杂交
( higher
stringency)
，两股链完全互补，特异地、稳定地形成双股链，高强 度杂交条件适用
于单基因座探针杂交。用单基因座探针在低强度杂交条件下也可获得多条谱带图像。分子 杂交
也可在
DNA
与
RNA
之间，或
RNA
与RNA
之间进行。


















第五节


DNA
指纹和
DNA
纹印





DNA
指纹和
DNA
纹印属于限制性片段长度多态性标记，
利用限制性内切酶将人类基因组
DNA
切割成不同长度的限制性片段，
经电泳分离后 ，
用特异探针杂交，
检测出不同片段长度的
等位基因。图谱的个体特异性取决于所用的 限制性内切酶和特异探针。技术核心是分子杂交。




一、

DNA
指纹图——多基因座
VNTR
(
一
)DNA
指纹——多基因座探针

人基因组
D NA
中一系列小卫星重复单位的核心序列有高度的同源性，因此，小卫星序列
可以交互杂交，如 采用核心序列多聚体作为探针，在低强度杂交条件下，只要与探针序列同源
性达到能稳定杂交的所有小卫 星片段均可同时被检出，一次可检出多个基因座，这类小卫星核
心序列多聚体探针叫多基因座探针
(multi locus probe)
，如
33
．
6
、
33
．
15
、
Myo
、
MZl3
等。用
多基因座探针检测得到的
DNA
图谱称为
DNA
指纹图。

(
二
)DNA
指纹图谱特征

多位点
DNA
指纹图利用小卫星序列具有同源性的特征，
在低强度杂交条件下，
使
DNA
探
针与不同染色体上
VNTR
基因座的靶片段杂交。
因此
DNA指纹图含有许多片段，
在
3-23kb
范
围内，
有
10 -30
条片段，
图谱极其复杂且携带大量的遗传信息，
具有人类遗传标记的各种特征。

1
．孟德尔遗传


通过大量的家系调查，发现
DNA
指纹图中大多数谱带，尤其是
4kb
以上
的大片段以均等机会由亲代传 递给子代，子代指纹图谱的所有谱带都可在双亲的指纹图谱中找
到，片段的传递符合按孟德尔遗传规律， 但子代的谱带不是简单的一半来自父亲，一半来自母
亲。来自母亲的谱带数可能与来自父亲的谱带数不同 。未发现任何一条谱带是特异地从父亲或
母亲传递给子女的，
排除性连锁遗传的可能性。此外，
DNA
指纹图中各谱带传递是独立的，
谱
带间没有连锁关系。只有当生殖细胞 发生突变，才有可能导致子代个体
DNA
指纹图的改变，
出现双亲不存在的陌生谱带。

2
．组织同一性


DNA
指纹图无论在体细胞 还是在生殖细胞中都是稳定的，同一个体的不
同组织的
DNA
指纹图都是相同的，无组 织间差异。同一个体的血液、精斑、毛发、肌肉、脑
组织、
骨等的
DNA
指纹 图谱完全一致。
离体细胞培养的细胞株仍保持与供体一致的
DNA
指纹
图。但 有两种情况例外：一种是不同组织之间甲基化程度不一样，当使用对甲基化敏感的

限
制酶如
HinfI
时，
不能识别和切割甲基化的酶识别点，
导致同一个体不同 组织
DNA
指纹图不一
致。但改用耐甲基化限制酶如
Hae
Ⅲ时，这 种差异就会消失；再一种就是组织细胞的癌变。由
于癌变细胞染色体丢失
DNA
或异常 扩增，
导致某一
DNA
谱带丢失或密度增强，
或出现额外带，
使癌变 组织与正常组织
DNA
指纹图不同。

3
．高度的个体特异性


通过对
DNA
指纹图的 统计计算表明，平均匹配概率在
10
-12
以下，
也就是说在
100
亿个人中，
方可找到两个
DNA
指纹图谱完全相同的个体，
足以说明
DNA
指纹
图的高度个体特异性。惟一例外的是同卵双生子，他们的
DNA< br>指纹图完全一致。

4
．突变率


分析父、子、母 的真三联
DNA
指纹图，发现子代
DNA
指纹图中出现父、母
均没有 的“陌生带”
，这是突变形成的新片段。早期
Jeffreys
等用探针
33
．
6
和
33
．
15
分析一
个亚洲印第安人 真实家系
4
代
54
个个体时，发现平均每
300
条子代片段 中出现
1
条陌生带。
对
1419
例真实家系调查结果分析，
33
．
6
探针的突变率为
0
．
5
％；
33
．
15
探针的突变率为
1.1
％。
在
1419个真实家系子代中，
出现
1
条陌生带的有
82
例
(26 .9
％
)
，
出现
2
条陌生带的有
7
例(1.2
％
)
。
Jeffreys
以及
Smith等人对真实家系的调查发现，子代
DNA
指纹图中含有
1
条或
2
条陌生带的
情况较常见。因此，在应用
DNA
指纹图进行亲子鉴定时，遇到存 在
1
条或
2
条陌生带时仍不
能否定亲子关系，应参考其他方法如PCR
、单基因座
DNA
纹印图的检验结果综合分析。在子
代
D NA
指纹图出现
3
条或
3
条以上陌生带的案子中，可以排除亲子关系 。
．

突变片段出现的主要原因是细胞在减数分裂过程中出现了基因交换与重组。VNTR
基因座
为高变区，多数小卫星序列本身就是基因组
DNA
内的重 组热点。
VNTR
基因座的重组与交换
同样也是形成等位基因片段的主要原因，
突变率过高对个体识别影响较小，
但对亲子鉴定不利。





(
三
)
法医学应用的几种多座位
DNA
指纹图
< br>1.
α
—珠蛋白—
3
′—
HVR
探针指纹图


α
—珠蛋白—
3
′—
HVR
探针
/限制酶
Hinf
Ⅰ对
200
名无关汉族个体进行
DNA
多基因指纹图分析在
3.0-23kb
范围内平均每个体片断数
16.8
条，
片断平均概率
0.198
，两汉族无关个体的偶合率
P
＝
0 .198
16.8
＝
1.5
×
10
-12
。

2.
33.6
和
33.15
探针指纹图


33.15
探针检测
Hinf
Ⅰ或
Hae
Ⅲ消化基因组DNA
的产物，在
4-20Kb
范围内平均能检测到
15
条带，
33.6
平均能检测到
11
条带。
33.15
探针检测无关 个体
DNA
指纹图完全相同的概率
3.0
×
10
-11，
33.6
探针检测无关个体
DNA
指纹图完全相同的概率
3. 0
×
10
-9
，两者累积为
5.0
×
10
-19
。

3. Myo
探针指纹图


Myo< br>探针检测
Hinf
Ⅰ或
Hae
Ⅲ消化基因组
DNA
的 产物，在
2.3-23Kb
范围内平均个体片断数
14
条，片断平均概率0.215
，无关个体
DNA
指纹图完全相同的概率
4.0
×< br>10
-9
。

4.
寡核苷酸多基因座探针
(CA
C)5/(GTG)5
指纹图


(CA
C)5/(GTG)5
探针检测
Hinf
Ⅰ为酶切
基因组
DNA
图谱，在
4Kb
以上平均有
13
条， 两个无关个体的偶合率
3.8
×
10
-10
。

1.3
探针指纹图


在
4.3-23Kb
范围内 有
18
条带，两无关个体间同时出现同一条带的
平均概率
0.205
，无关个体
DNA
指纹图完全相同的概率
6.0
×
10
-1 2
。

6.
JL-02
探针

是寡核苷酸探针核心序列为
(NGG)5

(GAGGTG)3
；
JL-02
探针检测
Hinf
Ⅰ
为酶切基因组
DNA
图谱，在
4Kb
以上每个个体平均有
16
条，两无关个体的偶合率
6.6
×
10
-15
。




(
四
)DNA
指纹的应用


DNA
指纹 技术的建立被迅速应用到法医学的个人识别和亲子鉴定中，对生物物证的鉴定
起到了巨大的推动作用。< br>
1
．个人识别

多基因座
DNA
指纹图提供的信息 量大，除同卵双生同胞外，任何两个无关
个体的
DNA
指纹图谱完全不同。在同一自显 影照片中两份生物检材相互比对，如果两生物检
材的谱带数目与位置不同，则可肯定两份检材不属于同一 个体；当两份指纹图的谱带位置与数
目均一致，称之为匹配
(match)
，可肯定两 份检材来自同一个体。目前应用的数个多基因座探针
在
3.0-20kb
范围内均可检 测出
10
—
30
条多态片段，群体中片段共有概率均在
0
．
25
以下。如
一例强奸案的多基因座
DNA
指纹图，
现场精 斑
DNA
与嫌疑人血液
DNA
经限制酶
Hinf
Ⅰ酶切，< br>α
—珠蛋白—
3
′—
HVR
探针杂交，
自显影图片中 显示
3kb
以上的有
13
条，
按共有一个片段平
13
-12
均概率
X
：
0.22
计算，两者来源于同一个体的偶合概率 为
0.22
＝
2.1
×
10
，偶合概率接近
0，
表明某无关的两个体被误认为同一个体的可能性几乎不存在，可以认定精斑为嫌疑人所留。

2
．亲子鉴定

DNA
指纹图的谱带遵循孟德尔遗传定律传递给 子代。
子代指纹图中所有谱带均应出现在父
亲或母亲的指纹图中。比较同一自显影片的孩子、假 定父母的指纹图谱，分析三者间的关系，
先在孩子指纹图中找出与母亲共有的谱带，剩下的谱带均为非母 亲带
(
设有
n
条
)
，如果没有突
变带出现，所有< br>n
条非母亲带均应在生父指纹图中找到。当孩子的
n
条非母亲带中至少有
3
条
以上不能在假定父中找到，则排除假定父与孩子的亲子关系；如果孩子的谱带均能在假设 父母
中找到，或只有
1
—
2
条不能在假定父母指纹图中找到，根据无 关个体共有
1
条带概率，计算
他们的相关机率。例如，子的非母带有
m
条
(n
—
2
≤
m
≤
n)
在假定父中找到 ，计算他们的相关机
率
X
(X
为无关个体共有
1
条谱带的概 率
),
认定是否有父子关系。
DNA
指纹图的高突变率也是
一个特点 ，亲子鉴定时发现有
1
—
2
条陌生带出现，下结论应慎重，要结合其他探针、
DNA
纹
印图或
PCR
方法等检验作出结论。

(
五
)DNA
指纹的局限性与潜在的问题

多基因座
DNA
指纹图一次检测获得最多遗传信息，其高度个体特异性是其他任何遗传标
记系统无法比 拟的，但在法医学应用中，也有其局限性和潜在问题。

1
．灵敏度低，检材用量大： 一次检测多基因座
DNA
指纹图至少需要
0.5
—
1.0
μ
gDNA
，
相当于
50
μ
l
的血液
(痕
)
、
5
μ
l
精液、
0.5
—
1.0
μ
g
组织。一般案件的检材难以满足此条件。

2
．
对基因组
DNA
的质量要求高：
提取的检材
DNA
分子至 少在
20kb
以上，
腐败检材或降
解
DNA
无法进行多基因 座
DNA
指纹图检验；并且检材
DNA
中不能含有抑制限制性内切酶活
性的抑制剂。
如果样品
DNA
中含有色素等杂质，
必须先进行
DN A
纯化，
否则抑制内切酶的消
化作用，得不到
DNA
指纹图。

3
．多基因座
DNA
探针没有种属特异性：实验证明，探针
33
．
15
和
33
．
6
不仅与人
DNA
有同源性，而且对狗、猫、鸡、鸟甚至鱼类的
DNA
也有同源性，可以发生杂交。同样
,
α
—珠
蛋白—
3
′—
HVR
探针与牛、马、狗 、鸡、鹿、鱼等
DNA
也有同源性；
MZl.3
探针是用噬菌体
DN A
筛选出来的，与常见野生和家养动物
DNA
均有相当高的同源性。常用的多基因座探 针均
能杂交检测出动物
DNA
。当物证检材中污染有动物
DNA
时， 可出现多余的额外带，严重干扰
对物证检材的检验，导致错误的结论。

m
4
．高突变率：在真实家系的子代存在
1-2
条陌生带
(
突变带
)
，陌生带的出现可能导致假排
除。因此出现陌生带时，判断结果要慎重，必要时应同时检测
2
个多基因座
DNA
指纹图或进
行其他系统的检验，避免误判。
5
．检验操作繁琐，实验环节多，实验周期较长
(5
—
7天
)
。

6
．存在统计学问题，指纹图谱带数多，而且呈连续分 布，测出的众多等位基因没有明确
的基因定位，个体同一性概率、亲子关系概率及群体数据的统计学计算 方法的理论尚待完善。

7
．电泳凝胶的变形和谱带的漂移等将不可避免带来误差，因 此不是同一块凝胶的分析结
果不能比对。
这也就造成在以往检验过的案件中，
如果嫌疑 人被排除，
在以后重新找到嫌疑人，
一旦原有检材已用完将不能再进行比对检验。

8
．不能解决来自
2
个以上个体混合检材的个体识别问题。

二、

DNA
纹印图——单基因座
VNTR
(
一
)
单基因座探针的特点


单基因座探针
(sinsle
locus
probe)
指在高强 度条件下，只检测出
单个基因座多态片段的探针，因此又称为基因座特异性探针
(locus
specific
probe)
，习惯称单位
点探针。由单基因座探针检测 得到的图谱称为
DNA
纹印图
(
单位点
DNA
指纹图
)
。单基因座探
针检出的多态性片段在杂合子个体中可检出
2
条带，即该基 因座的
2
个片段长度等位基因，纯
合子为一条带。单基因座探针多从基因组
D NA
中筛选，属小卫星探针。筛选评估探针的指标
除高特异性要求外，还包括：探针所检测基因 座的染色体位置，多态片段的长度范围，等位基
因数及在群体中频率分布，基因座杂合度、突变率及探针 的交叉反应等。





(
二
) DNA
纹印图谱的基本特征


1
．
高多态性与组织同一性


对于
VNTR基因座，
理论上相差
1
个重复单位就构成
1
个片
段长度 等位基因，
因此
VNTR
基因座上的等位基因数之多、
杂合度之高是任何常规 血型系统无
法比拟的。一个高度多态性
VNTR
基因座上的等位基因少则十几个，多达 数百个，尤其是高变
区内的基因座，都呈高度杂合状态，有的杂合度几乎接近
100
％ 。例如
D16S85
基因座的重复
单位为
17bp
，选用探针和限制 性内切酶
PstI
检出多态性片段范围为
0.5-6kb
，该基因座理论等< br>位基因数为
(6 000
÷
17)
≈
353
个。< br>根据中国北方汉族群体在
D2S44
、
D17S70
、
D14 S13
、
D14S1
、
DXYSl4
和
D18S27 6< br>个基因座的基因频率分布计算这
6
个基因座的累积个体识别机率和累积非
父排除 率几乎达到了
100
％。单基因座
DNA
纹印图是法医学个人识别、亲子鉴定 的有力工具。
与多基因座
DNA
指纹一样，各种组织具有同一性，可以根据不同组织进 行个体同—认定。

2
．孟德尔遗传规律


家系调查证明 ，单基因座
DNA
纹印图中片段的传递遵循孟德尔遗传
规律，子代的
2
条带
1
条来自于母亲，另
1
条来自于父亲。

3
．较高的突变率


减数分裂中出现了不等交换和重组，使等位基 因的重复单位数目增加
或减少，形成新的等位基因，在家系分析时孩子
DNA
图谱中出 现不能在生父和生母找到的谱
带，即陌生带。高突变率是
VNTR
基因座的特点之一。
DNA
纹印图能直观地揭示某一基因座
的突变情况，新的突变对个体的同一认定不会有 太大的影响，但在亲子鉴定中新出现的突变片
段可能会导致排除生父的错误。要求单基因座
DN A
纹印的突变率不得大于
0.2
％。对于个别突
变率较高的探针，如
D1S7
突变率大于
0.0380
，不适合于亲子鉴定。





4
．种属特异性


单基因座探针 均经过严格的筛选，在高强度杂交条件下，它不仅具有基
因座特异性，而且也具有高度的种属特异性，与 其他种属来源
DNA(
包括细菌
DNA)
不杂交，
因此即使混有其他 动物
DNA
的污染检材，其
DNA
纹印图谱亦不受干扰。




(
三
)
几种
DNA
纹印图介绍


国内从
1988
年开始有
DNA
纹印技术在法医学上的研究应用
报 道，
如
D2S44(PYNH24
／
Hae
Ⅲ和
PstⅠ
)
、
D14S1(pAC061
／
Pst
Ⅰ
)
、
D17S79(pAC256
／
Pst
Ⅰ
)
、
D18S27(pAC404
／
Pst
Ⅰ
)
等。

1
．
D2S44(PYNH24
探针／
Hae
Ⅲ或Msp
Ⅰ
) PYNH24
特异性探针，
是
Nakamura< br>等用人工合
成的
HBV
—
2
寡核苷酸
(GGACTG GGAGGAGTTGGGGG)
，
从质粒
CYNH24
的人体基因组文库< br>中分离出来长
2.0kb
的
Msp I
片段重组到
pUCl8
质粒中，
可识别
D2S44
基因座的
Hae
Ⅲ或
M spI
酶解基因组
DNA
产生的限制片段长度多态性。
PYNH24
探针／
Hae
Ⅲ酶解的
RFLP
图谱片段大
小为
1.02< br>—
6.26kb
，
分析
146
名北京地区无关汉族个体的杂合 度为
0.69
，
等位基因频率为
0.003
—
0
．
152
，相关机率为
3.6
×
10
-5
—
7.9
×
10
-2
。

2
．
D14S1< br>基因座
(pAWl01
探针／
EcoRI)

pAWl01
探针是人类
14
号染色体长臂端柱区域
中的一个
5.0kb
的片段，它与免疫球蛋白基因紧密连锁，可识别
D14S1
基因座。
pAWl01探针
检测
EcoRI
酶解基因组
DNA
的消化产物。
在
106
例广州地区无关汉族个体中，
检出
65
条长度
各异的 片段，片段长度分布在
9.4kb
—
30.2kb
之间，两个无关个体相同的 概率为
0
．
00048
。

3
．
D14S 13(pCEl.2
探针／
Hae
Ⅲ
)
基因座


pC El.2(D14S13)
探针是用一段人工合成的
16mer
的寡核 苷酸作为核心序列，筛选基因库，得到
Cosmid
PMLJl4
后，再经
MspI
酶解，将其中一
个
600bp
长的
VNTR
片段克 隆到
pUCl8
的
AccI
基因座后扩增得到的，因此也称为
PML Jl4
探
针。
296
名汉族无关个体的
pCEl.2
探针／
Hae
Ⅲ酶解的
D14S13
RFLP
片段长度范围为
1 .08kb-18.8kb
，杂合度为
0.94
，频率分布为
0.002—
0.051
。

(
四
)DNA
纹印图的法医学应用



1
．个人识别


单基因座纹印图只涉及一个
VNTR基因座，当两份生物检材的纹印图不
一致，就可以直接排除他们来源于同一个体，当两者图谱一致或 匹配
(match)
，则不排除它们来
自同一个体，需要加测其他基因座，最后进行无 关个体
DNA
纹印一致的偶合概率计算。偶合
概率计算可参照共显性等位基因控制系统 的偶合概率计算方法。若独立的多个单基因座纹印图
(
或单基因座和其它的遗传标记
)
一致，
可按乘法原则计算总偶合率。
选用
4
—
6
个 单基因座探针，
累计达到很高的个人识别能力。
需要注意的是由于片段长度测量误差、
部分现场物证检材
DNA
纹印存在正极漂移现象等原因，会使同一个体的现场遗留物证与新鲜血 样出现差异，结果本该
作同一性认定的却得出排除结论。

2
．
亲子鉴定


单基因座
DNA
纹印的 等位基因传递及基因型别类似共显性等位基因控制的
血型系统，
因此排除或认定亲生关系的原则 ，
亲权指数
(P1)
及父子关系相对机会
(RCP)
计算与共
显性等位基因控制的血型系统相同。
Balazs
计算
D2S44
、
D14S1
、
D14S13
、
D17S79
和
DXYSl 4
五个单基因座
DNA
纹印图累计非父排除率为
0
．
999 6
，几乎可以达到排除
100
％非亲生父亲的
准确结论。




(
五
)
单基因座
VNTR
—
DNA
纹印的优点及局限性

单基因座
DNA
纹印图技术与多基因座指纹图技术相比具有以下特点：
1
．所得图谱带简单明了，纯合子只有
1
条带，杂合子有
2
条带 ，易于理解，这在法庭辩
论中很重要。

2
．灵敏度高，获得标准
D NA
纹印图谱的最小
DNA
量为
50ng
，相当于
2ul< br>血液、
20ul
唾
液和
lul
的精液。

3.
能够有效鉴定混合样品，
纹印图中出现
3
条或
3条以上带时，
说明可能有
2
个或
2
个以
上样品存在。分 析样品为混合样品，如确定强奸是否为轮奸等。

4
．单基因座
DNA
探针在序列上具有高度的种属特异性，杂交条件为高强度杂交，人类单
基因座探针不会与其他种属DNA
杂交，细菌污染或污染有其他动物的标本，都不会影响结果
的分析。
5
．
DNA
纹印图中
DNA
片段长度相对小
(<10k b)
，可用于分析部分降解
DNA
样品，获取
有关的信息。

6
．检测结果重复性好，统计学评估容易理解，便于计算机管理与比对。

7
．
DNA
纹印图技术的等位基因呈连续分布，无法获得准确的等位基因频率；一个探针 只
检测一个基因座，所得信息量低，无法一次达到个体同一认定水平，需
4
—
6
个不同单基因座
探针联合检测，费时费力，这是
DNA
纹印图技术的缺点。

三、
DNA
指纹和
DNA
纹印的操作步骤


①
DNA
的提取；②限制性内切酶酶切；③电泳
分离；④印迹转移 ；⑤探针标记；⑥分子杂交；⑦
DNA
图谱的显现；⑧结果判读。





第六节

聚合酶链式反应

聚合酶链式反应
(polymerase
chain
reaction< br>，
PCR)
，是近年发展起来的一种体外扩增特异
DNA
片段的技术。 体外扩增的思想早在
1971
年就由
Khorana
及同事提出，在
1985
年由
Kary
Mullis
创立。此法操作简便，短时间内在试管 中可获得数百万个特异
DNA
序列的拷贝。
1993
年
Mullis
因此获得了诺贝尔奖。
PCR
技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域，在分子克隆、
遗传病的基因诊断、
法医学、
考古学等方面得到了广泛的应用，
而且与
PCR
相关的技术不断被
开发应用。目前大多数法医
DNA
分析技术均以< br>PCR
技术为基础进行分型。

一、

PCR
技术的原理

PCR
技术实际上是模拟生物体内的在模板DNA
、引物和
4
种脱氧核糖核苷酸存在下，依
赖于
DNA聚合酶的体外
DNA
酶促合成反应。
PCR
技术的特异性取决于引物和模 板
DNA
结合
的特异性，引物是
PCR
反应中最主要的成分。反应分 三步：
(1)
变性
(denaturation)
：首先是双链
DN A
分子在
95
℃左右高温下加热，

DNA
双螺旋配对碱基 间的氢键断裂，双链解离成单链
DNA
；
(2)
退火
(anneal ing)
：降低温度使引物和其互补的模板形成杂交链。由于模板分子结构较
引物要复杂的多， 而且反应体系中引物
DNA
量大大多于模板
DNA
，模板
DNA双链之间互补
复性的机会较少；
(3)
延伸
(extension)：在
DNA
聚合酶和
4
种脱氧核糖核苷酸底物及
Mg2+
存在
的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的
5
′—
3
′方向的< br>DNA
链延伸反应。

经过高温变性，低温退火和中温延伸
3
个温度的循环，模板上介于两个引物之间的序列不
断得到扩增。每循环一次，目的
DNA
的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的
DNA
以指数
的形式堆积，数量可达2
×
10
5-7
拷贝。在反应的最初阶段，原来的
DNA
担负着起始模板的作
用，随着循环次数的递增，由引物引导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因 此，绝大多
数扩增产物将受到所加引物
5
′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物
5
′端之间的
DNA
片段。

二、
PCR
反应

标准的
PCR
反应一般选用50-l00
μ
l
反应体系，
其中含有：
50mmol
／
L KCl
，
l0mmol
／
LTris
—
HC l(
室温下
pH 8.4)
，
1.5mmol
／
LMgCl
2
，
0.001
％明胶或牛血清白蛋白
(BSA)
，

2
个引物，各
0.25
μ
mol
／
L
，
4
种底物
(dA
TP+dCTP+dGTP+dTTP)
各
200
μ
mol
／
L
，模板
DNA(
人基因组< br>DNA)0.1
μ
g
，
TaqDNA
聚合酶
2.5u
。反应条件一般为
94
℃变性
30s
，
55
℃退火
30s
，
70-72
℃延
伸
30-60s
，
30
个循环。

三、
PCR
相关技术

PCR< br>—
SSO
技术在法医学主要用于
HLADQ
α
多态性检验，< br>PM
系统检
验；
PCR
—
RFLP
技术主要用于ABO
，
HLA
，
线粒体
DNA
等序列多态性分析；< br>SSP
—
PCR
技术
可用于
MN
基因型的分析；PCR
—
SSCP
技术；
MVR
—
PCR
技术 ；


APDR
技术等。

第七节


线粒体
DNA
分析简介

线粒体是存在于细胞质的一个含有双层膜的 重要细胞器，是细胞的氧化中心和动力站。几
乎人体所有细胞中均有线粒体，但不同组织细胞中线粒体的 数目有所差异，如肝脏、心肌、骨
骼肌等组织细胞中线粒体数目含量较多，每一个肝细胞中约有
1 000
—
2 000
个线粒体，可能与
这些组织中的代谢率高有关。线粒 体有自己的遗传系统，线粒体
DNA(mitochondrial
DNA
，
mtDNA)
是人类第二套基因组
DNA
，也是人类细胞中除核之外唯一含有
DNA
的细胞器。线粒
体也有自己的蛋白质翻译系统和遗传密码。
线粒体的基因组编 码
tRNA
、
rRNA
及一些功能蛋白
质，如电子传递链酶复合体中 的亚基，这些均参与维持线粒体系统的功能。由于受精卵中的线
粒体几乎全来自于卵细胞
(因为精子细胞中含有极少量的线粒体，只有
50
个拷贝
)
，所以线粒体< br>遗传系统往往表现为母系遗传，母亲所携带的
mtDNA
突变可传给她的子女。

一、人类线粒体基因组

mtDNA
是裸露的，不与组蛋白结合，存在于线粒 体的基质内或粘附于线粒体内膜。在一
个线粒体内往往有一至数个
mtDNA
分子。< br>mtDNA
的自我复制也是以半保留复制方式进行的。
线粒体基因组是人类基因组的重要 组成部分，剑桥大学的
Anderson
等人于
1980
年完成了对线
粒体基因组的全序列测定，
该序列可在基因库中找到，
称之为
Anderson序列或桥序列。
现都以
Anderson
序列作为标准，进行人线粒体
D NA
序列多态性比对。现代的线粒体是从古代的一个
细菌祖先进化衍生而来。人类线粒体基因组 的序列共含
16569
个碱基对
(
其中
5122A
，
5180 C
，
2171 C
，
4096T)
，为一条双链环状的
DNA
分子。双链中有一条为重链
(H)
，即富含嘌呤链；另
一条为 轻链
(L)
，即富含嘧啶链。这是根据它们的转录产物在
CsCl
中密度的不 同而区分的。线
粒体基因组共编码了
37
个基因，
其中
22
种基因编码
tRNA
分子
(
用于线粒体
mRNA
的翻译)
，
2
种编码
rRNA
分子
(
用于构成线粒体 的核糖体
12S
和
16SrRNAs)
，另外还有
13
个编 码氧化磷酸
化电子传递链和
A
TP
产生涉及的蛋白质和酶。
线粒体基 因组与核基因组相比要经济或紧凑，
核
基因组中编码功能的序列不足
10
％而 在线粒体基因组中只有很少非编码序列。