免疫组化原理、步骤及要注意的事项

2021年1月23日发(作者：宁鸿彬)
免疫组化

一，免疫组织化学简介


免疫组织化学又称免 疫细胞化学，
是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原
位通过抗原抗体反应和组织化学的呈 色反应，
对相应炕原进行定性、
定位、
定量
测定的一项新技术。
它把 免疫反应的特异性、
组织化学的可见性巧妙地结合起来，
借助显微镜
(
包括荧 光显微镜、
电子显微镜
)
的显像和放大作用，
在细胞、
亚细胞
水平检测各种抗原物质
(
如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等
)
。


二，免疫组化技术的基本原理


免疫组化技术是一 种综合定性、
定位和定量；
形态、
机能和代谢密切结合为一体
的研究和检测技 术。
在原位检测出病原的同时，
还能观察到组织病变与该病原的
关系，确认受染细胞类 型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。


免疫酶组化技术是通过共价键将 酶连接在抗体上，
制成酶标抗体，
再借酶对底物
的特异催化作用，
生成有色的 不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，
于普通显
微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原 成分的定位，
根据酶标记的部位可
将其分为直接法（一步法）
、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记
的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，
最好是特异性
强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，
间接法是将酶
标记在第二抗体上，
检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免 疫酶组化
间接染色法。


三，免疫组化步骤


1
，切片，烤片60℃，
1h
；


2
，脱蜡及复水


二甲苯
10min
，
100
％乙醇
5min
，
95
％乙醇
5min
，< br>90
％乙醇
5min
，
85
％乙醇
5min
，
80
％乙醇
5min
，
75
％乙醇
5min< br>，
60
％乙醇
5min
，
50
％乙醇
5mi n
，
30
％乙醇
5min
，
自来水
1min
，双氧水
1min
；


3
，
1
份30
％
H2O2
加
10
份蒸馏水，室温
10min，蒸馏水洗
3
次，每次
3min
；


4
，微波修复


将切片浸入
0.01M
枸橼酸缓 冲液，微波中最大火力（98℃
-
100℃）加热至沸腾，
冷却（约
5-10 min
）
，反复两次；


5
，将切片自然冷却至室温，< br>PBS
洗涤
3
次，每次
5min
；

6
，封闭，
5
％
BSA
，室温
20min
，甩 去多余液体；


7
，滴加一抗，37℃，
1h
，或者4℃过夜；


8
，
PBS
洗涤
3
次，每次
3min
；


9
，滴加二抗，37℃，
15-30min
；


10
，
PBS
洗涤
3
次，每次
3min
；


11
，滴加
SABC
，37℃，
30min
；


12
，
PBS
洗涤
3< br>次，每次
5min
；


13
，
1ml
蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；


14
，
DAB
显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约
5min
）
；


15
，自来水冲洗干净，过蒸馏水；


16
，苏木素复染
2min
，自来水冲洗；


17
，脱水

30
％乙醇
3min
，
50
％乙醇
3min
，
70
％乙醇
3min
，
80
％乙醇
3min
，
90
％乙醇
3min
，95
％乙醇
3min
，
100
％乙醇
3min
，二甲苯
20min
；


18
，树胶封片，镜检。


四，免疫组化常见问题分析

1
，石蜡切片在染色过程中出现脱片现象

1
）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

2
）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；

3
）有些组织 本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲
PBS
不要直接冲到组织
上，冲到组织上方， 让它流下冲洗组织；

4
）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。


2
，边缘效应

1
）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织 松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组
织下面试剂洗尽所致
.
解决办法：制备优质的 胶片（
APES
或多聚赖氨酸）
，切出
尽量薄的组织切片，不厚于
4
微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死
较多的组织；


2
）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心
组织高而致染色 深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘
2mm
。用
组化笔画圈时，为了 避免油剂的影响，画圈应距组织边缘
3-4mm
。


3
，产生组织切片非特异性染色


1
）抗体孵育时间 过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗
/
二
抗孵育时间、稀释抗体来控 制。这是最重要的一条；


2
）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；


3
）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组
织）< br>，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；


4
） 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时
间和适当增加浓度来加强封闭 效果；


5
）
DAB
孵育时间过长或浓度过高；


6
）
PBS
冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或
SP
孵育之后的浸
洗尤为重要；


7
）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。


4
，免疫组化染色呈阴性结果

1
）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；

2
）
抗原 修复不全，
对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，
以利于与抗体结合；建议 微波修复用高火
4
次
*6min
试试。有人做过实验，这是
最佳的时 间和次数。若不行，还可高压修复；


3
）组织切片本身这种抗原含量低；

4
）血清封闭时间过长；

5
）
DAB
孵育时间过短；

6
）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；

7
）开始做 免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方
法问题。


5
，背景

1
，考虑一抗浓度高；

2
，然后调整
DAB
孵育时间；

3
，也要考虑血清封闭时间是否过短；

4
，适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。



免疫组化的经验总结（
1
）－常见问题

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

1
、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本 和细胞标本两大类，
前者包括石蜡切片
（病理大片和组
织芯片）和冰冻切片，后者包括 组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片
是制作组织标本最常用、
最基本的方法，
对于组织形态保存好，
且能作连续切片，
有利于各种染色对照观察；
还能长期存档，
供回顾性研究；
石蜡切片制作过程对
组织内抗原暴露有一定的影响，
但可进行 抗原修复，
是免疫组化中首选的组织标
本制作方法。

2
、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固 定，
使得细胞内抗原形成醛键、
羧甲键而被封闭了部分
抗原决定簇，同时蛋白之间发生 交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行
IHC
染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固 定时分子之间所形成的交联破坏，
而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压 加热法，
酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是
pH6.0
的
0.01
mol/L
的柠檬酸盐缓冲
液。

3
、免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法，
免疫酶标法，
亲和组织化学法，
后者是以一
种物质对某种组织成分具有高度亲 合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更
高，
有利于微量抗原
(
抗体
)
在细胞或亚细胞水平的定位，
其中生物素——抗生物
素染色法最常用。






4
、抗体的保存：


抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼
硅酸玻璃。如储存 的抗体中蛋白浓度很低（
10-100mg/L
）
，就应另加隔离蛋白以
减少 容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用
0.1%-1.0%
的牛血清白蛋白。绝大多
数 已稀释的抗体应存在4℃
-
8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗
体原液 和已分离的免疫球蛋白组分应保存于
-
20℃条件下，并避免反复冻融。冷
冻的抗体溶 液应置于室温中缓慢地解冻，
应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污
染的抗体常会出现 假阳性结果，
应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。
为防止细
菌污染，
可于抗 体溶液中加入
0.01%
叠氮钠。
抗体经真空冷冻干燥后置
-
20℃ 以下
可保存
3-5
年。保存稀释后的单抗应加入
0.1%
叠氮钠浓度 。大多数稀释抗体可进
行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，< br>可在4℃下保存数月。

多聚赖氨酸溶液（
Poly-L-Lysine Solution
）

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织
切片与玻片黏合剂， 该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。
适用组织学，免疫组织化学，< br>冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，
以
防
实
验
操
作
过
程
中
组
织
掉
片
。
也
可
用
于
细
胞
培
养
，
增
加
细
胞
贴
壁
能
力
。

操作步骤（可直接在玻片上涂布）

1
．

灭菌的
ddH2O
1:10
稀释该多聚赖氨酸溶液。

2
．

用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温
18-26
℃

3
．

将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液
5
分钟
。 注意增加时间不会提高包被效果。

4
．在
60
℃烘箱
1< br>小时
干燥，或室温
18-26
℃过夜干燥待用。

[
注意
]

1
．

每
100mL
已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片
40-90
张，

超过
90
张片子将影响其黏合力。

2
．

用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含
1% HCl
的
70%
乙醇溶液来清洗。

4
．

释过的多聚赖氨酸溶液要放在
2-8
℃，至少在
3
个月内是稳定的。

5
．

用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。