免疫组化技术的原理、分类和优点

2021年1月23日发(作者：翟铁生)
免疫组化技术的原理、分类和优点

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2008-06-15 11:58

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一、免疫组化技术的基本原理

应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中 的某些化学成分进行原位的定
性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，
以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动
物 ，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用
某种酶
（常用辣根过氧化物酶）
或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，
将抗原放大，由
于 抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，
因此，
还必须借助于组织化学方法将抗原
抗体反应部位显示出来（常用显色剂
DAB
显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色< br>反应，
显示细胞或组织中的化学成分，
在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应 产
物，
从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、
含量。
组织或细 胞中凡是能作抗
原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病 原
体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

二、免疫组织化学染色方法
< br>1
、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱
性 磷酸酶）
、
铁蛋白、
胶体金等，
可分为免疫荧光法、
放射免疫法、< br>酶标法和免疫金银法等。

2
、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）；与直
接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

3
、按结合方式可分为抗原
—
抗体结合，如过氧化物酶
-
抗过氧化物酶（PAP
）法和亲
和连接，如卵白素
-
生物素
-
过氧化物 酶复合物（
ABC
）法、链霉菌抗生物素蛋白
-
过氧化物
酶连结（< br>SP
）法等，其中
SP
法是最常用的方法。

三、几种常用免疫组织化学方法的原理

1
、免疫荧光方法

是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体
标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，
在荧光显微镜下观察。
当抗原抗
体复 合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，
从而可确定组织中某种抗
原的定位 ，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所
以在临床病理诊断、检 验中应用比较广。

2
、免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光 后，
于
60
年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的
抗体与组 织或细胞作用，
然后加入酶的底物，
生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的
颗粒 ，
通过光镜或电镜，
对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术
是目前最常用的技术。

本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度 好，染色标本可长期保
存，适合于光、电镜研究等。

免疫酶标方法的发展非常迅速， 已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进
和创新，
其特异性和灵敏度都在不断提高，
使用也越来越方便。
目前在病理诊断中广为使用
的当属
PAP
法、< br>ABC
法、
SP
法等。

3
、免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作 为标记物。胶体金是指金的水
溶胶，
它能迅速而稳定地吸附蛋白，
对蛋白的生物学活性 则没有明显的影响。因此，用胶体
金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子
(< br>如葡萄球菌
A
蛋白
)
等作为探针，
就能对组织或细胞内的抗原 进行定性、
定位，
甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒，
且胶体金的 电子密度高，
所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研
究。
由 于胶体金本身呈淡至深红色，
因此也适合进行光镜观察。
如应用银加强的免疫金银法
则 更便于光镜观察。

四、免疫组化技术的优点

1
、
特异性强

免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具 有高度特异性，
因此，
免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（
keratin
）显示上皮成分，
LCA
显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在 交叉抗原时才会出现交叉反应。

2
、敏感性高

在应用免疫组化 的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法
等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、 几十倍；现在由于
ABC
法或
SP
法的出
现，
使抗体稀释上 千倍、
上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，
这样高敏感性的
抗体抗原反应 ，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3
、定位准确、形态与功能相结合

该技术通过抗原抗体反应及呈色反应， 可在组织和
细胞中进行抗原的准确定位，
因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观 察，
这
样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫组化技术的关键问题汇总（
1
）

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2008-06-23 15:02

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一、组织处理

恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的 内部因素，在
组织细胞材料准备的过程中，
不仅要求保持组织细胞形态完整，
更要保持 组织细胞的抗原性
不受损或弥漫，
防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经 丢失，
即使用很灵敏的
检测抗体和高超的技术，
也很难检出所需的抗原，
反而 往往由于组织的坏死或制片时的刀痕
挤压，在上述区域易出现假阳性结果。

1
、组织及时取材和固定

组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色 的关键第一
步，
是有效防止组织自溶坏死，
抗原丢失的开始，
离体组织应尽快 的进行取材，
最好
2h
内，
取材时所用的刀应锐利，
要一刀下去切开 组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，
组织
块大小要适中，一般在
2.5cm×
2.5cm×
0.2cm
，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚
的原则 ，
(
也就是说组织块的面积可以大到
3cm×
5cm
，
但组 织块的厚度千万不能超过
0.2cm
，
否则将不利于组织的均匀固定
)
。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅
速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形 态。

对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规
HE
病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，
而
HE
染色的常规组织处理是采用
10%
的中性缓冲福尔马林或
4%
缓冲多聚甲醛
4
倍于组织 体积进行组织固定，利用其渗透性强，
对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在
l2 h
内，一般固定时间不应超过
24h
。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出 强度将逐渐降低。

2
、组织脱水、透明、浸蜡

组织经固定后进 行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则
是脱水透明要充分但不能过，
浸蜡时间要够，
温度不能高，
否则造成组织的硬脆使组织切片
困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不 能完好平整，染色过程中极易脱片，对免
疫组化染色抗原的定位及背景都不利，
所以无水酒精脱 水和二甲苯透明的时间不宜过长，
正
常大小的组织无水酒精脱水
lh×
3次，
二甲苯透明
lh×
2
次即可，
浸蜡及包埋石蜡温度不要超< br>过
65
℃。

二、切片

组织得到很好处理后在进行 切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多
种多样的，
因染色操作程序复杂，时间较长，
有些抗原是要进行各种抗原修复处理，
如微波、
高压、
水溶酶 等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常
进行，
要求在贴片 前对载玻片作适当处理，
必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防
脱片。

1
、
Poly-L-Lysine (
多聚左旋赖氨酸
) < br>一般采用分子量
30000
左右的
0.5%
多聚赖氨酸
最好， 也可用试剂公司出售的其浓溶液以
1
：
10
去离子水稀释。方法是将玻片浸泡 其中，
倾尽余液，在
60
℃温箱中烤干备用，此方法的优点是可以用于多种组织化学、 免疫组化及
分子学检测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。

2
、
明胶硫酸铬钾法

将
2.5g
明胶加热溶于
500ml
蒸馏水中，
完全溶解冷却后加入
0.25g
硫酸铬钾搅匀 充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中
2min
，取出控尽液体入温箱中烤
干备用 。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应
注意，如果液体变蓝 或粘稠状停用。

3
、
APES (3-
氨丙基
-
乙氧基甲硅烷
)
此法必须现用现配。将洗净 玻片入
1:50
丙酮稀
释的
APES
中，浸泡
20s
，取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的
APES
晾干即可。
用此方法粘合的玻 片应垂直烤片不能平拷，否则组织片中易出现气泡。

切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平 整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片
在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为< br>3~4μm
，切好的切片在
60
℃温
箱中过夜，
注意烤片的温 度不宜过高，
否则易使组织细胞结构破坏，
而产生抗原标记定位弥
漫现象。

6
、显色

免疫组化染色的显色是最后的关键问题，
一般辣根过 氧化物酶
（
HRP
）
的检
测系统选用
DAB
或AEC
显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格
控制，以检出物达到 最强显色而背景无色为最终点，尤其
DAB
显色时间短着色浅，时间长
背景又深，都将 影响结果判断，根据经验
DAB
在配制完后最长宜放置
30min
以内，过时 不
能使用，
DAB
加到组织切片时作用时间最长不宜超过
10min
（最好在
5min
内），否则不管
有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的 组织用
DAB
显色时极易出现背景色更
应尽早在镜下控制，以达到最佳的分辨效果（棕 色）。
AEC
显色系统（红色）的弊端是易
溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂 为主，同时染色的切片也不能久存。

如果是碱性磷酸酶（
AP
）最好选用< br>NBT/BCIP
作为显色系统（结果染为蓝黑色）。

7
、结果判断

一是对以检测结果阳性细胞指数来定性
(
如核抗原的标记
)
，
判断方法是以一个视野中的
阳性细胞数与总细胞的百分比 ，再取
10
个相同视野算取平均指数；另一种方法以染色阳性
强度和阳性检出率相结合 而定，一般阳性细胞数在
0~25
为阴性，
25~50
为十，
50~ 75
为十
十，
75
以上为十十十。此种判定方法容易出现人为误差现象。有条 件的实验室最好能用图
像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。
一切的判定方法都是力求使 免疫组化染色结果
判断更标准，
但各单位采取的标准不尽相同，
所以判断标准化问题还 有待长期实践中病理学
术界商讨判定标准。

IHC
中常见的抗原表达模式有以下几种：

（
1
）
细胞浆内弥漫性分布，
多数胞浆型抗体的反应如此，
如细胞角蛋白
（
cyt okeratin
，
CK
）和波形蛋白（
vimentin
）等；< br>
（
2
）细胞核周的胞浆内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚， 如
CD3
多克隆抗体的染色；

（
3
）胞浆内局限性点状阳性，如
CDl5
抗体的染色；

（
4
）细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如
CD20
、
CD45RO
；

（
5
）细胞核阳性，如
Ki -67
及雌、孕激素受体蛋白
ER
、
PR
等。一种抗体可同时出现< br>细胞浆和细胞膜的阳性表达，如
EMA
可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应；
CD 30
抗体可同
时呈膜性和胞浆内点状阳性反应等。

影响免疫组化染色质量的 因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量
好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗 原修复手段，严格的技术操作和对照等。

假阴性反应可发生在：①组织内待测抗原已被分解破 坏，或抗原含量过低；②抗原被
遮盖，多由于醛类固定剂的使用，使组织中的大分子蛋白借醛键形成交联 而遮盖待检抗原；
③抗体质量不佳或稀释度不当；④技术操作失误等。

假阳性反应可 发生在：①抗体与非待检抗原发生交叉反应，在使用多克隆抗体时易出
现；
②组织对抗体的非特 异性吸附，
特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液
体时容易发生；
③内 源性过氧化酶的作用，
在脾脏、
骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出
现；
内 源性碱性磷酸酶的作用，
特别是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷
酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果；④判断失误，
将肿瘤组织中残留的正常组织的免
疫组织 化学阳性信号误认为是肿瘤的染色反应；
⑤当肿瘤浸润破坏正常组织时，
使被破坏的
正 常细胞胞浆内的可溶性蛋白释放，
后者被肿瘤细胞非特异吸附或吞噬，
使瘤细胞出现该种
抗原的阳性反应；⑥外源性和内源性色素的干扰。