免疫荧光操作步骤及注意事项

2021年1月23日发(作者：施之皓)
免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基 础上建立起来的一项技
术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用
这种荧光抗体
(
或抗原
)
作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(
或抗体
)
。利用荧光
显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定 抗原或抗体的性质和定位，以及
利用定量技术
(
比如流式细胞仪
)
测 定含量。


紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

免疫荧光实 验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透
(
或称为透化
)
、封闭、
抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备
(
通俗的说法是细胞爬片
)
是免疫荧光实 验的第
一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一
切都无 从谈起。这一步关键的是玻片
(Slides or Coverslips)
的处理以及细胞 的活
力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通
透步骤最 重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固
定程序对于获得好的实验结果是 非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它
方法
(
如
ELISA
或
Western Blot)
中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫
荧光 实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更
加关键。最后需要注意的是 ，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片
后在
4?
或
-20?< br>避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多， 同时在分析结果时无法像
WB
那样可以根据分子量的大
小区分非特异性识别，所以要得 到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量
的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立 严谨的实验对照。总之，免
疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照 ，每
步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验
目的。< br>
基本实验步骤
:
(1)
细胞准备。对单层生长细胞，在传代 培养时，将细胞接种到预先放置有处
理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS
洗两次
;
对悬
浮生长细胞，取对数生长细胞，用
PBS< br>离心洗涤
(1000rpm,5min)2
次，用细胞离心
甩片机制备细胞片或 直接制备细胞涂片。

(2)
固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完 毕后的细胞可置于含
叠氮纳的
PBS
中
4?
保存
3
个月。
PBS
洗涤
3×5 min.

(3)
通透。使 用交联剂
(
如多聚甲醛
)
固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育
前 ，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑
抗原蛋白的性质。通透的 时间一般在
5-15min.
通透后用
PBS
洗涤
3×5 min.

(4)
封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为
30min.
(5)
一抗结合。室温孵育
1h
或者
4?
过夜。
PBST
漂洗
3
次，每次冲洗
5min.
(6)
二抗 结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育

漂洗
3
次，每次冲洗
5min
后，再用蒸馏水漂洗一次。

(7)
封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

(
一
)
细胞准备

用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生 长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经
过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后 涂片。贴壁良好