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ELISA原理和分类(附图解)

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-23 18:32

儿童脑瘫症状-

2021年1月23日发(作者:富文)

一、
ELISA
的原理

ELISA
的基础是抗 原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗
原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,
又保留酶的活性。
在测定时,
受检标本
(测定其中的抗体或抗原)
与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗
涤的方 法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗
原或抗体,
也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一
定的比 例。
加入酶反应的底物后,
底物被酶催化成为有色产物,
产物的量与标本中受检物质< br>的量直接相关,
故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高,间接地
放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

二、
ELISA
的类型

ELISA
可用于测定抗原,也可 用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:


1
)固相的抗原或 抗体,即

免疫吸附剂


immunosorbent



2
)酶标记的抗原或抗体,称为

酶联物



结合物


conjugate




3
)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条 件,可设计出各种不
同类型的检测方法。用于临床检验的
ELISA
主要有以下几种类 型:

(一)

双抗体夹心法测抗原




双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:


1


将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。


2


加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形 成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。


3


加酶标抗体,
保温反应。
固相免疫复合物 上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合
的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受 检抗原的量相关。


4


加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。

在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如
HBsAg

HBeA g

AFP

hCG
等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体 ,
就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清,
包被和 酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆
抗体,
一般选择两个针对抗 原上不同决定簇的单抗,
分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的 特异性,
而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,
作一
步法检测。
< br>在一步法测定中,
当标本中受检抗原的含量很高时,
过量抗原分别和固相抗体及酶标抗< br>体结合,而不再形成

夹心复合物

。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现 象,此时反应后显


色的吸光值
(位于抗原过剩带上)
与标准曲线
(位于抗体过剩带上)
某一抗原浓度的吸光值
相同,
如按常法测读,
所得结果将低于实际的含量,
这种现象被称为钩状效应

hook effect

因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。
钩状效应严重时,
反应甚至可 不显色而出现假阴性结
果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中
HBsAg

AFP

尿液
hCG
等)时,应注意可测范 围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削
弱钩状效应。

假使在被测分 子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如
HBsAg

a
决定簇,也可< br>用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在
HBsAg
的检测中应注意 亚型
问题,
HBsAg

adr

adw

ayr

ayw4
个亚型,
显然每种亚型均有相同的
a
决 定簇的反应性,
这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一注 意点是类风湿因子(
RF
)的干扰。
RF
是一种自身抗体,
多为IgM
型,能和多种动物
IgG

Fc
段结合。用作双抗体夹心 法检测的血清标本中如含有
RF

它可充当抗原成份,
同时与固相抗体和酶标 抗体结合,
表现出假阳性反应。
采用
F

ab'


Fab
片段作酶结合物的试剂,
由于去除了
Fc
段,
从而 可消除
RF
的干扰。
双抗体夹心法
ELISA
试剂是否受
R F
的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见
6.2


< br>双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,
但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原,因其不能形成两位点夹心。

(二)双抗原夹心法测抗体

反应模 式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,
以检测相应的
抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
此法中受检标本不需稀释,
可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗
HBs
的检测常采用本法。< br>本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

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