地中海贫血的诊断方法.doc

2021年1月23日发(作者：支大纶)

地中海贫血的诊断方法

B-
地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查，方法主要有：

1
血常规检测



地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，如
MCV
≤
80 fl
，
MCH
≤
25
．
0 Pg
，则可疑为地中海贫血患者或基因携带者

，
可同时测定血清铁和铁蛋白，以排除缺铁性贫血。

2
红细胞渗透脆性试验
(
一管法
)

其原理是地中 海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩
展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在< br>0
．
32
％
(
或
0
．
36
％
)NaC1
中溶解度降低
(
脆性降低
)
。
一管法 可用于地中海贫血群
体筛查。

3
血红蛋白
(Hb)
电泳
Hb
电泳

是检测地中海贫 血、
异常血红蛋白最常用的方法，
可观察到
HbE
、
HbH
等异常血红蛋白区带，
同时可定量检测
HbF
、
HbA2
的含量并区 分常
见类型的地中海贫血。有研究显示
MCV
、
Hb
电泳和红细胞脆 性实验三
者联合检测的灵敏度可达
100
％

，
阴性预告值达
100
％

，
联合特异度
可达
100
％

，阳性预告值达
100
％
DS
。

4
高效液相色谱技术
(HPLC)


原理：
采用 微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术，
全自动分析
仪可分离血红蛋白的变异体与亚型，容易发现 重型和轻型
B
地中海贫
血。在操作上，
HPLC
采用的是全血标本， 不需要制备
Hb
液，只要将全
血标本直接放在仪器上，通过电脑操作便能实现
HbA
、
HbA2
、
HbF
等定
量检测。优点：所需样本量 少，自动化程度高，操作简单，快速，能
消除人为误差，结果准确。
HPLC
也可用于 胎儿脐带血的产前诊断，可
诊断出重型
B
地中海贫血，
但不能区分正常胎儿和 杂合子胎儿

。
近年
来，地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测

。

5
基因诊断



近年来，< br>随着分子生物学研究领域的不断发展，
从最初的
B
珠蛋白
基因簇限制性 酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应
(PCR)
技术结合
其他分子生物学方法，B
地中海贫血的诊断已逐步改进和完善。基因
诊断方法有下列几种：

5
．
1
限制性片段长度多态性连锁分析
(RFLP
连锁分析
)

原理：
DNA
限制性内切酶可识别并切割
DNA
上特定的核苷酸序列 ，
得到
一定长度的
DNA
片段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成，
从而改变酶切片段的大小。
突变基因在经过相应的限制性内切酶水解
后，
其电 泳条带的数量和大小就会发生改变，
根据这些改变可判断出
突变是否存在。缺点：由于单独使用 该方法，不能直接测出受试者突
变基因的类型，
必须结合寡核苷酸探针等技术，
故其应 用范围有一定
限制，
且操作繁琐。
如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子，
无法用此方法进行产前诊断，
或者患儿和父母所有位点上都是杂
合状态，只能 进行
50
％

的排除性诊断。

5
．
2
探针斑点杂交技术
(
allele
—
specific oligonucleotide
ASO)

应用引物扩增珠蛋白基因，
同时合成与正常序列和突变序
列完全互补的寡核苷酸探针。将
PCR
扩增产物 点在尼龙膜上，分别与
标记的正常和突变的
ASO
探针杂交，不完全互补的探针，在一 定条件
下可以完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位
B
珠
蛋 白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅与突
变探针杂交。这种检测方法快速、灵敏 。缺点：对
DNA
的纯度和数量
要求较高，一次杂交能检测一种突变，对于具有高度异 质性的
B
地中
海贫血往往需要多次更换探针杂交，
才能确定诊断，
如 使用同位素标
记探针，还存在放射性污染等问题。

5
．
3
反向点杂交方法
(Reverse
dot
blot
hybridization
，
RDB)
与传统等位基因特异性寡核 苷酸探针点杂交的基本原理相同，
所不同
的是：将膜上固定探针取代固定靶
DNA，经一次杂交就可对未知样品
中多个突变进行检测，
改变了传统杂交法一次只能检测一种突 变的方
式。优点：较快速、敏感，操作简单。缺点：只能检测已知位点突变
的
B
地中海贫血，不能检出未知突变。

5
．
4
缺口
PCR(gap PCR)
原理：设计三个或两对引物，即在
缺 失区域外侧，
靠近缺失位点的位置设计一对引物，
另外一个或一对
引物在缺失区域内。
在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人中扩
增出片段，在缺失纯合子中不能扩增。在缺失区 域外侧的一对引物，
因为缺失使相距甚远的两端
DNA
拉进，从而可扩增出特定的DNA
片断。
从而检测出纯合子患者，杂合子携带者。
Wang
等

报道用此方法对
89
个
B
珠蛋白基因突变的检测。

5
．
5
扩增不应突变系统
(amplification refractorymutation
sys
—
tems
，
AR MS)
或称等位基因特异性
PCR
原理：
在
PCR
中，
针对