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地中海贫血的诊断方法
B-
地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查,方法主要有:
1
血常规检测
地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血,如
MCV
≤
80 fl
,
MCH
≤
25
.
0 Pg
,则可疑为地中海贫血患者或基因携带者
,
可同时测定血清铁和铁蛋白,以排除缺铁性贫血。
2
红细胞渗透脆性试验
(
一管法
)
其原理是地中 海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩
展,膜与内容物之比增大,对渗透溶解的抗性增加,在< br>0
.
32
%
(
或
0
.
36
%
)NaC1
中溶解度降低
(
脆性降低
)
。
一管法 可用于地中海贫血群
体筛查。
3
血红蛋白
(Hb)
电泳
Hb
电泳
是检测地中海贫 血、
异常血红蛋白最常用的方法,
可观察到
HbE
、
HbH
等异常血红蛋白区带,
同时可定量检测
HbF
、
HbA2
的含量并区 分常
见类型的地中海贫血。有研究显示
MCV
、
Hb
电泳和红细胞脆 性实验三
者联合检测的灵敏度可达
100
%
,
阴性预告值达
100
%
,
联合特异度
可达
100
%
,阳性预告值达
100
%
DS
。
4
高效液相色谱技术
(HPLC)
原理:
采用 微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术,
全自动分析
仪可分离血红蛋白的变异体与亚型,容易发现 重型和轻型
B
地中海贫
血。在操作上,
HPLC
采用的是全血标本, 不需要制备
Hb
液,只要将全
血标本直接放在仪器上,通过电脑操作便能实现
HbA
、
HbA2
、
HbF
等定
量检测。优点:所需样本量 少,自动化程度高,操作简单,快速,能
消除人为误差,结果准确。
HPLC
也可用于 胎儿脐带血的产前诊断,可
诊断出重型
B
地中海贫血,
但不能区分正常胎儿和 杂合子胎儿
。
近年
来,地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测
。
5
基因诊断
近年来,< br>随着分子生物学研究领域的不断发展,
从最初的
B
珠蛋白
基因簇限制性 酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应
(PCR)
技术结合
其他分子生物学方法,B
地中海贫血的诊断已逐步改进和完善。基因
诊断方法有下列几种:
5
.
1
限制性片段长度多态性连锁分析
(RFLP
连锁分析
)
原理:
DNA
限制性内切酶可识别并切割
DNA
上特定的核苷酸序列 ,
得到
一定长度的
DNA
片段,而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成,
从而改变酶切片段的大小。
突变基因在经过相应的限制性内切酶水解
后,
其电 泳条带的数量和大小就会发生改变,
根据这些改变可判断出
突变是否存在。缺点:由于单独使用 该方法,不能直接测出受试者突
变基因的类型,
必须结合寡核苷酸探针等技术,
故其应 用范围有一定
限制,
且操作繁琐。
如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子,
无法用此方法进行产前诊断,
或者患儿和父母所有位点上都是杂
合状态,只能 进行
50
%
的排除性诊断。
5
.
2
探针斑点杂交技术
(
allele
—
specific oligonucleotide
ASO)
应用引物扩增珠蛋白基因,
同时合成与正常序列和突变序
列完全互补的寡核苷酸探针。将
PCR
扩增产物 点在尼龙膜上,分别与
标记的正常和突变的
ASO
探针杂交,不完全互补的探针,在一 定条件
下可以完全洗脱,再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位
B
珠
蛋 白基因正常,仅与正常探针杂交,反之,均带有突变时,则仅与突
变探针杂交。这种检测方法快速、灵敏 。缺点:对
DNA
的纯度和数量
要求较高,一次杂交能检测一种突变,对于具有高度异 质性的
B
地中
海贫血往往需要多次更换探针杂交,
才能确定诊断,
如 使用同位素标
记探针,还存在放射性污染等问题。
5
.
3
反向点杂交方法
(Reverse
dot
blot
hybridization
,
RDB)
与传统等位基因特异性寡核 苷酸探针点杂交的基本原理相同,
所不同
的是:将膜上固定探针取代固定靶
DNA,经一次杂交就可对未知样品
中多个突变进行检测,
改变了传统杂交法一次只能检测一种突 变的方
式。优点:较快速、敏感,操作简单。缺点:只能检测已知位点突变
的
B
地中海贫血,不能检出未知突变。
5
.
4
缺口
PCR(gap PCR)
原理:设计三个或两对引物,即在
缺 失区域外侧,
靠近缺失位点的位置设计一对引物,
另外一个或一对
引物在缺失区域内。
在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人中扩
增出片段,在缺失纯合子中不能扩增。在缺失区 域外侧的一对引物,
因为缺失使相距甚远的两端
DNA
拉进,从而可扩增出特定的DNA
片断。
从而检测出纯合子患者,杂合子携带者。
Wang
等
报道用此方法对
89
个
B
珠蛋白基因突变的检测。
5
.
5
扩增不应突变系统
(amplification refractorymutation
sys
—
tems
,
AR MS)
或称等位基因特异性
PCR
原理:
在
PCR
中,
针对
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