珠海 试管婴儿PCR实验室操作流程

2021年1月22日发(作者：吉大试管婴儿吗)
一、
INFORMATIONFORTEST
检测信息

项目名称

方法

方法依据

乙型肝炎病毒核酸

聚合酶链反应

卫生部
《全国临床检验 操作规程》
第三版
（
2006
）
第七篇第六章第一节

二、
ANALYTICALPRINCTPLE
检测原理

聚台酶链 式反应
(PCR
〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，
而实时荧光定量
P CR
技术，
是指在
PCR
反应体系中加入荧光基团，
利
用荧 光信号积累实时监测整个
PCR
进程，
最后通过标准曲线对未知模
板进行定量 分析的方法。
在实时荧光定量
PCR
反应中，
引入了一种荧
光化学物 质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使
用
TaqMan
荧光探针的 检测原理：
PCR
扩增时在加入一对引物的同时
加入一个特异性的荧光探针，
该探针为一寡核苷酸，
两端分别标记一
个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整 时，
报告基团发射的
荧光信号被淬灭基团吸收；
PCR
扩增时，
Ta q
酶的
5
’一
3
’外切酶活
性将探针酶切降解，
使 报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，
从而荧光
监测系统可接收到荧光信号，
即每扩增一 条
DNA
链，
就有一个荧光分
子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一）< br>。这样就可以通过荧光
强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。






三、操作步骤

（一）试剂配制

1
、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出
HBV-DNA
检测试剂盒。查< br>看外包装盒
(
包括生产批号、有效期
)
，无误后拆开试剂盒，取出核酸
提取液、反应液及
Taq
酶
(
核对核酸提取液、
HBVPC R
反应液及
Taq
酶
管上批号与试剂外包装盒批号是否一致
)
（图
1
）
，
不一致则不可使用，
需更换新的试剂。室温平衡
20min
，完全融化后
2000rpm
离心备用。













2
、核酸提取液的分装

（
1
）取离心管架置于超净工作台 内
(
开机前用紫外线消毒
30
分钟
)
，
用右手拿起 镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外
壁，不能碰到管内壁
)
，摆放顺 序为横列从左往右摆，竖列为从上往
下隔行排，离心管个数为
n(n=
样本数
+
对照品
+
质控品
)
。完成后将镊
子放回原位（图
2
）
。









（
2
）用移液器准确吸取核酸提取液
50ul
分装至离心 管中
(
左上角第
一排开始，
从左住右依次加入）
。
因核酸提 取液内含固体沉淀颗粒物，
为使颗粒均匀分布，
故每次取样时都要用移液器反复吸打
3 -4
次
（图
3
）
。分装完毕后将移液器量程归位。










（
3
）加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹
紧离心管下部，然后 用食指将盖子盖上，顺序为：从右下角第一个开
始，从右住左依次盖上（图
4
）
，离心管盖全部盖完后，通过传递窗
转移至标本处理区。










3
、
HBV- DNA
反应液的配制

每批需设置空白对照、阴性对照、临界阳性对照（同时检测低值
阳性质控品，则无需再检测临界阳性对照〕
、阳性质控品、阳性标准
品。所需每批需配 制数
n=
样本数
+
对照品
+
阳性标准品
+
质控品，每个
测试反应体系配制如下表：

试剂

用量（
ul
）


HBV PCR
反应液


Taq
酶


（
1
）
每盒
HBV-DNA
试剂可检测
32
人份，
根据每日需检测标本份数计
算出每批所需
HBV
PCR
反 应液和
Taq
酶用量（例有
111
人份需要进行
检测，则有
3
盒试剂可直接使用
10ul
移液器将
Taq
酶加入
HBV PCR
反应液中，另有
111-3*32=15
人份试剂需将
HBV
PCR
反应液和
Taq
酶
使用移液器按反应体系比例吸取至离心管中配制（ 图
5
）
。











（
2
）取出离心后备用的
HBV PCR
反应液和
Taq
酶，按上述要求配制
后用旋涡振荡器振荡混匀
5-10sec
，然后再用离心机
2000rpm
离心
10sec
备 用（图
6
）
。








（
3
）
从操作台面上拿取
HBV-DHA试剂配制盒
(
可选用空余的
200u1
枪
头盒
)
至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应的孔位右旁按
顺序编号（图
7
）。编号规则为：样本扩增反应管对应的孔位按相应
的样本流水号编写、阳性质控品反应管对应的孔位 编“
Q
”
（如有高值
则标为
H
，低值为
L)
，阴性对照品孔位编“
-
”
，临界阳性对照对应的
孔位编“±”
， 空白对照对应的孔位编“
B
”
，
1
号标准品对应的孔位
编“
S1
”
，
2
号标准品对应的孔位编“
S2
”
，依此类推。











（
4
）编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反应管(ABI7300
使用的是八
联一薄壁反应管，镊子应夹住反应管外壁，不可接触到内壁。 按（图
8
）所示方向依次将所有反应管
(
反应管数
=n)
隔 列摆放到配置盒上。







< br>（
5
）
从离心机中取出已混好
Taq
酶的
PCR反应液，
用移液器
(
量程调
至
36ul)
，准确吸取反 应液并按从上到下、从左至右的顺序依次加至
反应管中，注意：吸头应深入到反应管底部，放液时应缓慢 ，切勿形
成气泡（图
9
）
。全部加样完毕后将配制盒通过传递窗转移至样本处
理区。










（二）标本处理

1
、标本、质控品及对照品的处理

（
1
）从冰箱冷冻室取出
HBV DNA
阳性质控品、阴性对照品， 室温平
衡
20min
待其完全融化。

（
2
）核对 标本和原始申请单的条形码和检验项目，无误后依次粘贴
上相应的流水号，如




ADICON

P 0001

2016-01-12

2
、从传递窗中取出试剂准备区分装好核酸提取液的 离心管架，移至
生物安全柜内在管盖上用记号笔写上阿拉伯数字
1
、
2
、
3
、
......
，
阳性质控管标上“
Q
”< br>（如有高值则标为
H
，低值为
L)
，阴性对照管标
上“
-
”
，临界阳性对照管标上“±’
，
。离心管盖上标记的是
1，就表
示该管要加入流水号为
P0001
的标本（图
10
）。