血清脂类测定

2021年1月22日发(作者：艾显)

血清脂类测定

血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。

目前，对 有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程，均必须检测血浆（清）中的脂类，通过其含量
的变化，对临床疾患 提供协助诊断的依据。有关医学科研工作，脂类的定量检测也是一项必备的研
究项目。

1
．胆固醇测定

血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类 ：一类是化学法包括抽提法和直接
测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特异快 速，并能自动化分析，已常
规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差 异。目前公认的参考
方法是
Abell-Kendall(L-B
反应
)法。另外，三氯化铁
-
硫酸反应法（
Zak
法）具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约
5
倍于
L-B
反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度 比较接近等优点，缺点是特
异性差，干扰因素比
L-B
法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸 ，血清样品中的血红蛋白，胆红素以及硫
酸的质量等因素均可影响
Zak
方法的准确性 ，
Zak
法更适合于科研使用。酶法测定血清胆固醇的方
法已被广泛采用，
国 产试剂已能满足临床的需要。
胆固醇测定用的标准品，
按美国国家标准局
（
N BS
）
出品纯度达
99.8%,
是国际公认的参考物，
国内李健斋等 已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，
已
供临床检测血清胆固醇使用。

2
．甘油三酯测定

血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。化学 法测定甘油三酯是以脂蛋白变性，水
解成甘油，并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯，除 去脂肪酸，再测定甘油，方法
特异，准确而快速，临床广为应用。目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘 油为依据，然而血清样
品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在 研究讨论这一问
题。若不减去，其测定值将会高于血清样品中的真值，如果要减去，就必须先测出血清样 品中的游
离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做到。有报道血清样品中 的
游离甘油实际量是
0.07
～
0.13mmol/L
，
相 当于甘油三酯的
0.5
～
6.0mmol/L
，
为此建议，
实测的甘油
三酯量减去一个校正系数即：

甘油三酯（
mmol/L
）
=[0.98
×总甘油（
mmol/L
）
]-0.07
（
mmol/L
）。

这一校正系数也仅适用于健康人，对临床病人并不一定适 用。据报道，血清样品的游离甘油一
直是个未知数，无法测准。为此，目前临床测定血清甘油三酯时，基 本上未考虑游离甘油，因为其
含量很少，
暂且忽略不记。
甘油三酯测定的参考物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物
（
2
：
1
，
W/W
），此参考物适用于化学法。在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。

3
．磷脂测定

血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他 少量磷脂。如需要分别检测各种
磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。目前，临床仅 测定血清磷脂总量。血清
磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。化学法是以磷脂中的磷为定量依 据，因为每磷脂分
子中都含有一个磷酸根，故将磷脂的磷称为脂性磷。由于血清中磷脂大部分为卵磷脂， 其分子量中
磷约占
4%
，
故将脂性磷换算成磷脂的系数，
一般为25
。
由于化学法均需要抽提，
再测抽提液中的磷
脂的磷，血清中的磷酸 盐不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。酶法
是利用磷脂酶进行定量测定。 生物体中磷脂酶包括磷脂酶
A
1
、
A
2
、
C
和
D
四种。
磷脂酶
D
特异性差，
均可水解卵磷脂、溶血卵 磷脂和神经磷脂，三者约占血清总磷脂的
95%
，临床多用含磷脂酶
d
的试
剂进行磷脂的定量测定。

4
．游离脂肪酸测定
游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸，故又称为非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必须是灵
敏的方 法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。测定方法有：①滴定法需要微量滴定装置，因
为要通过肉眼 观察颜色，
难免会有主观因素的影响，
所以难以测定准确，
很难用于常规；
② 光度法，
以铜皂法常用；③酶法，主要采用特异性不强的脂肪酶
D
进行检测，方法特异 ，快速准确，已常规
应用于临床。


第一节

胆固醇测定

血清中胆固醇包括
CE
和
FC
，酯型 的
CE
占
70%
，
FC
占
30%
。
CE
中的
C
3
的
-OH
在
LCAT
作用 下，可
分别结合亚油酸（
43%
）、油酸（
24%
）、软脂酸（10%
）、亚麻油酸（
6%
）、花生四烯酸（
6%
）、硬
脂酸（
3%
）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在
LDL
中最多，其次是< br>HDL
和
VLDL
、
CM
最少。血清总
胆固醇测定方 法分为化学法和酶法两大类。

1
．化学法

化学法一般包括：①抽 提；②皂化；③毛
地黄
皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的
方法有
Sperry-Webb
法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去< br>②、③步骤的
Zak-Henly
法及省去③步骤的
Abell- Kendall
法，现将此法作为标准参考方法予以引
用。

2
．酵法测定

CE
在胆固醇酯酶（
cholestero lesterase
）作用下水解成
FC
和
NFFA
，
TC
再经胆固醇氧化酶
（
cholesterol
oxidase,COD）
氧化成△
4
胆甾烯酮和
H
2
O
2
。
再分别定量
O
2
的消耗或者
H
2
O
2的生成量，
或者△
4
胆甾烯酮生成量
,
以作为
TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用
量少，便于自动生化分析仪作批量测定 。


一、
Abell-Kendall
改良法

1
．原理

血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使 胆固醇酯加水分解成游离胆
固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油 醚层，蒸发至干，再
进行
Liebermann-Burchard
显色反应，620nm
比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇
的提取定量。

2
．试剂组成

代
种类

号

R1

乙醇

R2

石油醚

R3

水醋酸

R4

无水醋酸

浓度









组

成

优质纯

沸点
68
℃，特级纯

分析纯

胆固醇分析用，不含
HCI

贮存
2
～
8
℃

有效时间

















R5

浓硫酸

R6

KOH
液



分析纯













临
用
前
配
制

配制后

1h

内用完



33%(W/W)

KOH10g+H
2
O20ml

R194ml+R66ml



R7

乙醇性
KOH
液



R8

Liebermann



Burchard



试剂
*







R420
体积
+R51
体积
+R310
体积





准
品


0

胆
固
醇
标
R9

胆固醇标准液

5.17mmol/L

200mg+R1→100ml

*
：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至
10
℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置
10min
，又加冰醋酸混匀，备用。

3
．操作


图
15-1
血清胆固醇（
Abell
法）测定操作图

按图
15-1
操作。

4
．计算

标准总 胆固醇浓度
=E
SA
/E
ST
×
5.17(mmol/L)

二、酶法（
CEH
、
COD-POD
法）
< br>首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（
CEH
）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆 固醇氧化
酶（
COD
）作用下，生成△
4-
胆甾烯酮和
H< br>2
O
2
，再
H
2
O
2
经过氧化物酶 （
POD
）作用在
4-
氨基安替比林
（
4-AA-P
）及
N-
乙基
-N-
（
3-
磺基醋酸）
-3甲氧基苯胺
（
N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidi ne,ESPAS
）参与下，生成红色醌亚胺色素。


H
2
O
2
+ESPAS+4-
氨基安替比林→红色醌亚胺色素

（一）手工测定法

1
．试剂组成

代号

种类



Na
2
HPO
4



Na
2
H
2
PO
4



胆酸钠

浓度

组成

贮
2
～
8
℃

有效时间



























24h











50mmol/L



50mmol/L



3mmol/L





4-
氨基安替比林

0.82mmol/L



R1*

ESPAS

14mmol/L



33U/L

117U/L

6700U/L



Carbowax-6000

0.17mmol/L





CEH



COD



POD

R2

标准液







5.17mmol/L

用异丙醇溶解胆固醇



*
混匀，调
pH
至
6.70
±
0.10(25
℃
)
，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

2
．操作

按图
15-2
操作。

3
．计算

标准总 胆固醇浓度
=E
SA
/E
ST
×
5.17(mmol/L)
（二）自动化分析仪测定

以
CL-7200
型全自动生化分析仪检测为例。

1
．试剂组成

A
液：
CEH
、
POD
、抗坏血酸氧化酶等。

B
液：
COD
、
4-
氨基安替比林等。


图
15-2
血清胆固醇测定（酶法）操作图

2
．上机参数

项

目

方

法

波

长

反应温度

参

数

终点法

双波长（
540nm
，
700nm
）

37
℃

试剂
A
反应时间

2
～
3min

试剂
B
反应时间

5
～
6min

样本用量

试剂
A
用量

试剂
B
用量

单位

3
．操作过程

3μl

250μl

120μl

mmol/L


4
．计算

以△
A=A2-A1
，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。

5
．注意事项

（
1
）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

（
2
）试剂在有效内
2
～
8
℃避光食保存。

（
3
）胆固醇含量超过
200mmol/L
，需用生理盐水稀释再测。

第二节

甘油三酯测定

甘油三酯又称中性脂肪，由于其甘油骨架上 分别结合了
3
分子脂肪酸、
2
分子脂肪酸或
1
分子
脂肪酸，相应称为甘油三酯（
TG
）、甘油二酯（
DG
）和甘油一酯（
MG
）。血清中
90%
～
95%
是
TG
，
TG
中结合的脂肪酸分别为油酸（
44%
）、软脂酸（
26%
）、 亚油酸（
16%
）和棕榈油酸（
7%
）。

血清
TG
测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。

血 清中
TG
的化学组成并不单一，准确求其分子较为困难。因标准不同，测定结果存在差异。化< br>学法多采用三棕榈精（软脂精）
（分子量
807.3
）、三油精（分子量
895.4
）为标准，按摩尔浓度计
算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。

1
．化学法

化学测定法包括：①
TG
的抽提分离；②皂化 ；③甘油糖的氧化；④氧化生成甲掌显色定量等四
个阶段。操作较为繁杂，影响测定因素太多，本法准确 性差，一般很少用。

2
．酶法测定

酶法测定包括：①
T G
的抽提与皂化；②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。目前常规检测应
用的方法有甘油激酶 （
glycerolkinase,GK
）法和甘油氧化酶（
glycerol Oxidase,GOD
）法。操作简
便，快速准确，并能在自动化生化分析仪上进行批量 测定。


一、乙酰丙酮法

1
．原理

血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯，经
KOH
皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在 过
碘酸作用下氧化成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的
3
，
5
二乙酰，
1
，
4
二氢
甲基吡啶，其颜色的深浅与甘油三 酯的含量成正比，
420nm
测定定量。该法可用于基本功训练及组
织细胞
T G
的提取测定。


2
．试剂组成

代号

R1

R2

种类

浓度

抽提液



吸附剂



组成

（
CH
3
）
CHOH
（
A .R
）重蒸馏

氧化铝，水洗除去微细颗粒，


贮
有效时
2-8
℃

间



闭封



一周

110℃烤干
3h
以上

R3

R4

R5

R6

R7

R8

40ml+R-7
100ml+R-4
显色剂


80ml

R9

参考液

2mg/dl

皂化剂

5%

醋酸溶
2mol/L

液

KOH 5g+H
2
O→100ml

CH
3
COOH 11.5ml+H
2
O→100ml

















一周



过碘酸
0.05mol/L

NaIO
4
1.07g+H
2
O→100ml

钠

氧化剂



醋酸铵


液

R4 1
体积
+R51
体积

CH
3
COONH
2
15.4g+H
2
O→100ml

CH
3
COCH
2
COCH
3
0.75ml+R-1



三油酸甘油酯




2mg+R-
1→100ml
（
TG100mg/dl
）





3
．操作

按图
15-3
操作。


图
15-3
血清甘油三酯（乙酯丙酮法）测定操作图

4
．计算

血清
TG
浓度
=E
SA
/E
ST
×
1.13( mmol/L)

二、酶法（
GK-GPO-POD
比色法）

血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（
GK
）及
A TP
存在下，生成
3-
磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（
GPO
）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成
H
2
O
2
，
H
2
O
2
与底物
4-
氨
基安替比林和
ESPAS
在过氧化物酶
（
POD
）
作用下，
生成红色亚醌化合物
（
quinoneimine
）
，
比色
（
500nm
）
，
其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。