金属螯合镍填料

2021年1月21日发(作者：贝塞麦)
镍离子金属鳌合亲和层析介质（
Ni-NTA
）说明书

1

简介


金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用 蛋白质表面的一些
氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如
Cu
，
Zn，
Ni
，
Co
，
Fe
发生特殊的相互作
用，能 够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离
子的琼脂糖凝胶就能 够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作
用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨 酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远
小于组氨酸残基与金属离子的结合力。


镍
NTA
亲和层析介质（
Ni-NTA
）具有特异性好 、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径
小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性 好，批次重复性好。本产
品已经螯合好镍离子，使用更方便。


2+
2+
2+
2+
3+
2

性能参数：


特点


基质


配体


配体密度


吸附载量


基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便


6%
的交联琼脂糖凝胶


Ni
2+

10-
20μmol /ml

15mg
蛋白
/ml

介质颗粒大小


45-
165μm

最大流速


pH
范围


保存温度


保存液体


150cm/h

3-10
，在位清洗时
pH
范围可到
2-11

+4-8
℃


20%
乙醇



3

适用范围


分离带
His
标签的重 组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。


4

应用实例



实验名称：
Ni-NTA
分离带
His
标签的重组蛋白


实验步骤：



1
、
Ni-NTA
装柱，
1.6×
20cm
，柱床体积为
10ml
；



2
、用缓冲液
1
平衡
2~5
个床体积 ，流速为
2ml/min
；


3
、将
20ml
细胞破碎液
(50mM
PBS
，
pH7.4
，
0.5M
NaCl)0.45μm
滤膜过滤，上样，流速为
1ml/min
；


4
、用缓冲液
1
再洗
2~5
个床体积，流速为< br>2ml/min
；



5
、用分别含
10
、
20
、
50
、
100
、
200
、
300
、
400mM
咪唑的缓冲液
3
进行阶段洗脱，流速 为
2ml/min
，收集各阶段洗脱峰，用
SDS- PAGE
检测融合蛋白的分子量大小和纯度；


6
、用纯水流洗< br>5
个柱床体积，再用
20%
的乙醇流洗
3
个柱床体积，流速为
2ml/min
，柱子置
于
4-8
℃环境中保存。


缓冲液组成：


缓冲液
1
：
50mM pH7.4
的
PBS
缓冲液。配制：
0.5M NaH
2
PO
4
19ml
，
0.5M Na
2
HPO
4
81ml
，
NaCl 29.3g,
加适量水溶解后定容到
1000ml
。


缓冲液
2
：
50mM
磷酸盐缓冲液，
pH7.4
，即
pH7.4< br>的
PBS
溶液。配制：
0.5M NaH
2
PO
4
19ml
，
0.5M Na
2
HPO
4
81ml
，
NaCl 29.3g
和咪唑
34g,
加适量，水调
pH
后定容到
1000ml
。


缓冲液
3
：不同咪唑浓度的缓冲液
B
配制：


咪唑浓度

缓冲液
1
量
(ml)
缓冲液
2
量
(ml)
10 mM
20 mM
50 mM
100 mM
200 mM
300mM
400 mM
98
96
90
80
60
40
20
2
4
10
20
40
60
80
SDS-PAGE
流程：



1
、
BCA
法测量样品蛋白浓度


2
、根据测定样品的蛋白浓度，算出
5~10μg/
孔所需的体积。


3
、
向
1.5ml EP
管中加入含
5~10μ g
蛋白的样品溶液，
若体积小于
10μl
，
则加
20mM PBS pH7.4
补足
10μl
；若体积大于
10μl
，则要加入
1ml
无水乙醇，－
20
℃下浓缩
1h
。



4
、取浓缩样品
10000rpm
离心
15m in
，除去上清，
37
℃烘箱
10min
去除残余的乙醇。


5
、
在样品加入
20mM PBS pH7.4
和
2×
loading buffer
各
10μl
，
100
℃下
10min
。
取出后冷却
30s
，
4000rpm
离心
1s
。


6
、点样，电泳。


实验结果：



（
1
）使用
Ni-NTA Agarose
纯化
His
标签重组蛋白


His
标签重组蛋白的上样量为
20ml
，用分别含
20
、
50
、
100
、
200
、
300
、
400mM
咪唑的缓
冲液
B
进行洗脱，色谱结果见图
1
，色谱各组分的
SDS-PAGE
结果见图
2
。



图
1
.
Ni-NTA Agarose
纯化带
His
标签重组蛋白色谱图



图
2. SDS-PAGE
图谱

1
、

标准蛋白，



2
、上样液，



3
、流穿液，



4
：
20mM
洗脱液，



5
：
50mM
洗脱液，

6
：
100mM
洗脱液，




7
：
200mM
洗脱液，




8
：
300mM
洗脱液，




9
：
400mM
洗脱液。


（
2
）使用
Ni-NTA Agarose
纯化
His
标签重组蛋白包涵体


条件和 前面的方法基本相同，只是缓冲液中加了
8M
的脲，溶液配方如下表，其纯化色谱
图和 电泳图分见图
3
、图
4
。


要注意的是不同的包 涵体溶解度不同，也可以用
6M
盐酸胍代替
8M
脲，因为盐酸胍溶解
包涵体更完全。


缓冲液组成：


缓冲液
1
：
50mM pH7.4
的
PBS
缓冲液。配制：
0.5M NaH
2
PO
4
19ml
，
0.5M Na
2
HPO
4
81ml
，