Ni树脂再生之详细步骤

2021年1月21日发(作者：聂超)
镍柱琼脂糖树脂（
Ni-NTA resin
）再生方法


摘

要：




镍柱纯化是为了纯化带 有
6
个组氨酸（碱性氨基酸）标签的重组蛋白而设计，具有高度
的亲和力和选择性。当
Ni-NTA
琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时，需彻底再生后
才能使用。< br>再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等三个步骤。
先用变性剂和
乙醇除去 残余蛋白和脂类，再用
EDTA
与金属镍离子螯合去除镍，然后用
NiSO4
进行挂镍。




蛋白中的组氨酸残基可以和许多金属离子，例如 锌、铜、镍、铁等形成复合物。因此，
带有金属离子的柱料能选择性螯合具有组氨酸残基的蛋白质。半胱氨酸和络氨酸残基也能和
固定化金属螯和，
但是亲和力比组氨酸要弱。
金属螯 和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分
耦联琼脂糖柱料。

镍柱纯化是为了纯化带有< br>6
个组氨酸标签的重组蛋白而设计的，
Ni
柱中的硫酸镍
(NiSO4 )
可
以与碱性蛋白结合。镍柱纯化系统设计了镍柱琼脂糖对串联排列的
6-His（碱性氨基酸）残
基有高度的亲和力和选择性。用咪唑洗脱目的蛋白时，咪唑会竞争性结合
Ni
，目的蛋白被
洗脱下来。



如果纯化同一种蛋白，
Ni-NTA resin
不需要再生，可以重复使用
3-5
次。
通常在使用
3-5
次
后，结合效率有所下降，需用
0.5M NaOH
洗涤，也可用
6M
盐酸胍加
500mM
咪唑洗
5-6
个
柱体积，然后用结合缓冲液平衡后即可再使用。但是，当
Ni-NT A
琼脂糖的颜色由浅蓝色变
成灰褐色或白色时，则镍离子已经从柱子中丢失，
Ni-N TA
树脂需彻底再生后才能使用。再
生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等几个步 骤，具体方法如下：

一、所需试剂：

再生缓冲液：
6M
盐酸胍
+ 0.2M
乙酸

2% SDS
（
m/V
）

25%
、
30%
、< br>50%
、
75%
、
100%
的乙醇（
V/V
）

100mM EDTA
（
pH8.0
）溶液

100mM NiSO4
溶液

二、镍柱（
Ni- NTA
）树脂再生步骤：

（
1
）从层析柱下端流干所有溶液，用< br>2
倍
NTA
树脂体积的再生缓冲液洗。

（
2
）用
2
倍体积的去离子水洗。

（
3
）用
3
倍体积的
2% SDS
洗。

（
4
）用
1
倍体积的
25%
乙醇洗。

（
5
）用
1
倍体积的
50%
乙醇洗。

（
6
）用
1
倍体积的
75%
乙醇洗。

（
7
）用
5
倍体积的
100%
乙醇洗。

（
8
）用
1
倍体积的
75%
乙醇洗。

（
9
）用
1
倍体积的
50%
乙醇洗。

（
10
）用
1
倍体积的
25%
乙醇洗。

（
11
）用
1
倍体积的去离子水洗。

（
12
）用
5
倍体积的
100mM EDTA pH8.0
洗。

（
13
）用
3
倍体积的去离子水洗。

（
14
）用
2
倍柱体积的
100mM NiSO4
洗。

（
15
）用
2
倍柱体积的双蒸水洗。

（
16
）用
2
倍柱体积的再生缓冲液洗。