Ni柱纯化His-tag蛋白质

2021年1月21日发(作者：苏纪兰)
Ni
柱纯化
His-tag
蛋白质




一

非变性条件下抽提
His-Tag
蛋白质





下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续
6
个组氨酸尾（
His Tag Protein
）

的具有天
然结构的可溶性重组蛋白质（
Native
Protein
）
。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具
有
His- Tag
结构，提供的层析方法可供参考。

1.
样品准备

1)
准备细胞，
接种，
诱导表达。
对于实验室用的
pET
载体表达系列，
在细胞
OD600=0.5-0.8
时，用
1mM IPTG
诱导
1-3
小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于
-70
度或立即
进行步骤
2
操作。

2)
加入
1/20
细胞生长体积的
NTA-0 Buffer
（
20mM Tris-HCl pH7.9
，
0.5M NaCl
，
10% Glycerol
）
和
PMSF
。PMSF
用无水乙醇配制成
200mM
储存液，
-20
度或4
度保存；
PMSF
使用的工作
浓度位
1mM
；注意：
PMSF
见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。

3)
将 细胞悬浮起来，
加入溶菌酶
（工作浓度位
0.2-0.4mg/ml
，
如果表达的宿主细胞内含
pLysS
或
pLysE
，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置
30
分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上
操作。

4)
加入
10% Triton X-100,
使
Triton< br>的终浓度为
0.05%
，充分混匀，冰上放置
15
分钟，间或
混匀）
；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。

5)
加入
1M < br>MgCl2
，使
MgCl2
的终浓度为
1mM
，混匀。加入< br>DNase,
使
DNase
的终浓度为
10mg/ml
，混 匀，室温放置
10
分钟。

6)5000
转
/
分< br>（
20,000xg
以上）
，
4
度离心
15
分钟以上。
取上清，
置于冰上备用或
-20
度保存。

2
．层析

1)
将
NTA
树脂装入合适的层析柱 ，层析用
10
倍
NTA
体积的
NTA-0 Buffer
洗。

2)
将样品（步骤
2
（
6）
）加到
NTA
层析柱中，流速控制在
15ml/
小时左右，收 集穿透部分，
用于
SDS/PAGE
分析蛋白质的结合情况。

3)
层析用
5
倍
NTA
体积的
NTA-0 Buffer
洗，流速控制在
30ml/
小时左右。

4)
分别用
5
倍
NTA
体积的
NTA-20
，
NTA- 40
，
NTA-60
，
NTA-80
，
NTA-100，
NTA-200
，
NTA-1000
Buffer
洗脱，流 速控制在
15ml/
小时左右，收集洗脱液，每管收集一个
NTA
体积。
5)
确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是
SDS/PAG E
分析。也可以用
BBST
的
Bradford
蛋白质测定试剂盒 ，快速确定蛋白质的含量，然后用
SDS/PAGE
分析蛋
白质的分布。
< br>6)
目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
纯化的目标蛋白质的保存条 件需
要根据蛋白质的性质和用途确定。



附溶液配方：

NTA-0 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole(
咪唑
)
NTA-40 Buffer:
20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 40mM Imidazole(
咪唑
)
NTA-60Buffer:
20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 60mM Imidazole(
咪唑
)