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流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程
流行性乙型脑炎
（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于
地鼠肾细胞，
培育后收获病毒液，
加入甲醛溶液将病 毒杀死后制
成。用于预防乙脑。
1
毒种
1.1
毒种来源
P3
株病毒，
每
3
～
5
年应用新分离的乙脑流行株病毒检查
P3
株的保护力，以了解该毒株的有效性。
P3
株干燥毒种由中国药
品生物制品检定所分发。
1.2
毒种检定
1.2.1
无菌试验
毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。
1.2.2
病毒滴定
每正代必须用体重
7
～
9g
小白鼠进行 脑内滴定，滴度
≥9.0LogLD
50/1.0ml
可用于生产。
1.2.3
纯毒试验
生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种
的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。
中和指数必须在
500
以上。
生产过程中如对毒种发生疑问，
应及
时进行鉴定。
1.3
毒种传代
分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过
15
代
称正代，
由正代传递一代直接用于生产称亚代。
每次用于传代 的
毒种不得少于
3
个鼠脑。
传代时选用体重
7
～
9g
健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，
72
小时后选眼结膜正常，有典型痉 挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，
无菌取脑并进行无菌试验。
1.4
毒种保存
鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于
-
60℃以下，无 菌试
验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成
10%
脑悬液，
分装小 瓶冻存于
-
60℃以下，无菌试验合格后备用。
2
疫苗制造
2.1
细胞制备
2.1.1
地鼠
选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。
2.1.2
细胞消化及培养
取肾剪碎，
用适量的胰蛋白酶溶液消 化。
用营养液分散细胞，
制备细胞悬液，分装培养瓶，于
37℃进行培养。营养液中牛 血
清含量不得超过
8%
。
2.1.3
外源因子检查
每生产批细胞留
5%
（或不少于
500ml
）
悬液作为对照细胞检
查外源病毒。
该细胞除不接种病毒外，
细胞浓 度和处理均与生产
过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。
并用
0.2%
～
0.5%
豚鼠红细胞（4℃保存不超过
7
天）进行血吸附
试验，
置
4
～8℃30
分钟判定结果，
再置
20< br>～25℃30
分钟再次判
定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种
细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。
2.2
病毒接种和培育
挑选生长良好的细胞瓶，充分淋洗细胞后加入适量维持液，
接种病毒，
病毒量不得＞
7.0LogLD50/1.0ml
。
在适当温度下 培育
适当时间，
弃去病毒培养液，
换以新维持液，
继续培育一定时间。
疫苗生产过程中不得加青霉素或其他
β
内酰胺类抗生素。
2.3
原液
2.3.1
过滤
选择有典型细 胞病变的培养瓶，
经肉眼检查无菌者进行澄清
过滤，细胞质量好时，可再加入新维持液，继续培 育，再次收获
病毒液。
2.3.2
病毒灭活
过滤后的 原液，
于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛
溶液，其最终浓度不得超过
0.05 %
，置适当温度下一定时间灭活
病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过
0.01%
。
2.3.3
原液检定
2.3.3.1
无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.3.3.2
病毒滴定
每个滴定批代表疫苗不得超过
15
万
ml
，将样品
10
倍系列
稀释，
取至少
3
个稀释度，
每个稀释度用体重
7
～
9g
小白鼠
4
只，
每只脑内 接种
0.03ml
，逐日观察，
3
日内死亡者不计，观察
14
天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml
判为合格，不合格者可重试一次。
2.4
半成品
2.4.1
半成品取样
无菌 试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液，取样做灭活试
验、
效力试验和无菌试验。
每次解 剖的地鼠制备的疫苗为一生产
批，按生产批进行检定，但每批灭活试验代表疫苗量不得超过
15
万
ml
，每批效力试验代表疫苗量不得超过
100
万
ml< br>。无菌试
验按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.4.2
半成品检定
2.4.2.1
灭活试验
（
1< br>）动物法：将样品脑内接种体重
12
～
14g
小白鼠
8
只，
每只
0.03ml
，同时腹腔接种
0.5ml
，为 第一代；
7
天后将第一
代小白鼠处死
3
只，取脑做成
10%
悬液，脑内接种
6
只小白鼠，
为第二代；
7
天后将第二代小 白鼠处死
3
只，同法接种
6
只小白
鼠，为第三代。从接种之日起逐日 观察
14
天，每代小白鼠除处
死和接种后
3
日内非特异性死亡者外， 全部健存为合格。
若传代
3
日后有个别小白鼠死亡，
应立即取死鼠 脑乳化成悬
液再接种
3
只小白鼠，观察
14
天，该
3
只小白鼠健存仍判为合
格。
如仍有小白鼠死亡，
该批疫苗应重试，
重试合格 后仍可使用。
若传出活病毒应重试，
查明原因。
必要时继续灭活并进行灭活试
验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。
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