醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

2021年1月21日发(作者：劳培)
浙

江

工

业

大

学

生

物

与

环

境

工

程

学

院

第九届
―
昂立杯
‖
学生课外学术科技作品竞赛






醛缩酶基因的克隆

及其在大肠杆菌中的表达
















作




者：


童



小



龙
















所在班级：


生物工程
0803













小组成员：


林浩、马斌祥














指导教师：


柳



志



强




2010
年
11
月



摘要：
本研究根据已知的编码醛缩酶的基因序列，设计一对特异性引物，以实验室保藏菌株
ZJUTB-DER A
的
基因组
DNA
为模板，利用
PCR
技术扩增得到约750bp
的片断，将该片断与克隆载体
pMD18-T
连接并测序，
根 据测序结果，
重新设计一对引物，
并在两端加上
NcoI
和
SalI
的识别位点序列，
通过
PCR
获得长度为
684bp
的醛缩 酶编码基因，将所得片断定向克隆至
pET28b
载体中，转化至
BL21
感 受态细胞中，筛选出了阳性克
隆子。利用
IPTG
对阳性菌进行诱导，并对表达产物进 行了分离纯化，
SDS- PAGE
电泳检测出在约
24kD
处
有 一蛋白表达带，对重组基因工程菌的酶进行测定，结果为
133.8U
。

关 键词：
2-
脱氧核糖
-5-
醛缩酶、基因克隆、表达、酶的纯化


引言

他汀类药物
(Statins)
是
20< br>世纪
80
年代后期开发的一种降血脂药物，作为
3-
羟基
-3 -
甲基
戊二酰辅酶
A(HMG- CoA)
还原酶抑制剂，通过与该酶竞争性结合，使
HMG- CoA
无法转变
成甲羟戊酸

(Mevalonate)
，甲羟戊酸 是合成内源性胆固醇的原料，从而阻断胆固醇的合成，
降低血胆固醇的水平。
此外，
他 汀类药物还具有降低甘油三酯、
提升高密度脂蛋白水平等重
要作用，
因此，
他 汀类药物在预防和治疗冠心病、
动脉粥样硬化等方面有着广泛的应用。
另
外有研究显示 ，他汀类药物还可以影响肿瘤细胞的生存与发展，具有一定的抗肿瘤作用。

据统计数据表明， 在调
/
降血脂药物市场中，他汀类原料药所占的市场份额约为
180
多
亿美元，占全球调
/
降血脂类药物
60%
的市场份额。因此，随着部份药物 专利到期，各制药
企业和相关研究机构积极投身于他汀类药物的生产和研发。
目前全球已开发的 他汀类药物有
十多个品种，如洛伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀等，从各类他汀的化学结构中
发现它们普遍都具有一个手性的侧链基团，
其结构是二羟基酸或是
（杂）
环芳 香内酯。
由于
在化学合成该手性侧链的过程存在着成本高、
污染严重，
反应步 骤长，
合成收率低，
副反应
多，
产品分离纯化难度大等缺点。
同时，
随着生物催化与生物转化研究的飞速发展，
结合生
物酶法与化学法合成他汀侧链逐渐成 为研究热点。
醛醇缩合反应是碳碳键生成的有效反应之
一，
2-
脱氧核糖-5-
磷酸醛缩酶
(DERA,
EC
4.1.2.4)
则是 不对称直接醛醇缩合反应的高效催化
剂，它可以在水溶液中、中性
pH
条件下催化不对 称碳碳键的形成，因此受到研究者的广泛
关注。

DERA
是一种无需磷酰化 体的独特的生物催化剂，它可以催化
D-
甘油醛
-3-
磷酸与乙醛
反 应生成
2-
脱氧
-D-
核糖
-5-
磷酸酯。
该醛缩 酶正在成为强大的用于工业合成手性分子的工具，
它可以利用乙醛或和
2-
取代乙醛为 底物，通过
4-
取代
-3-
羟基正丁醛中间产物来生产
2,4,6-
三脱氧己糖或其衍生物。此类
2,4,6-
三脱氧己糖及其衍生物是他汀侧链的合成前 体。与其它
酶类相比，
DERA
合成他汀侧链具有原料结构简单易于检测分析，
且来源丰富、
价格低廉等
优点。
目前研究最多的是利用乙醛和氯乙醛反应生产
6-
氯
-2,4,6-
三脱氧吡喃糖苷。
利用
DERA
催 化的羟醛缩合反应来生产他汀侧链具有一定的不足之处，
主要表现为生产能力低，
原因是
该酶对醛类物质（包括乙醛、氯乙醛等）的耐受性较差，在高浓度底物存在下，醛缩酶极易
失活。在研 究初期，该反应是在低底物浓度，低温（
2-4
℃），高酶浓度下，经过
7
天 的反
应时间，才达到
100g·
L-1
的产物浓度。

本文作者根据
NCBI
公布的醛缩酶编码基因序列，设计了一对引物，利用实验室保藏
菌株
ZJUTB-DE RA
的基因组
DN
为模板，扩增得到了编码醛缩酶编码的基因序列，并构建
了 含有编码醛缩酶结构基因的原核表达载体
pET28b-DERA
，成功地使其在
E.
coli

BL21
中
进行了活性表达，本文报道有关研究结果。

1
材料与方法

1.1
工具酶和试剂

基因组提取试剂盒购 自
MP
公司，质粒提取盒、
PCR
产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒
均 购自
Axygen
公司，各种工具酶均购自
Takara
（宝生物）公司，配 制微生物培养基所用酵
母粉、蛋白胨为
OXOID
公司产品。

1.2
质粒，菌株与培养条件

所用克隆载体为
pMD18-T< br>，
表达载体为
pET28b
，
宿主大肠杆菌为
JM109(r ecA1 sμpE44
endA1
hsdR17
gyrA96
relA1thi
△
(Lac
—proAB)
F’[traD36
proAB+
lacIq
lacZ
△
M15])
和
BL21(DE3)(
F-
，
ompT
，
hsdS(rBB-mB
－
)< br>，
gal
，
dcm(DE3))
，均为本实验室保存。
LB
培养
基
（
g/L
）
：
胰蛋白胨

10
，
酵母提取物

5
，
氯化钠

5
，
pH 7.0
。
需要时使用前加入
100
μ
g/mL
氨苄青霉素
(Amp)
或卡那霉素
(Kan)
，固体培养基添加
2 %
琼脂，用于大肠杆菌培养。

1.3
酶缩酶基因的克隆

1.3.1 ZJUTB- DERA
基因组
DNA
的提取

从甘油管中吸取
100
μ
L
的保藏菌种，
加入到
LB
培养基中，
37
℃，
250 rpm
摇床培养
越
24 h
，收集菌液，采用快速核酸提取仪及微生物基因组提取试剂盒提取
ZJUTB- DERA
的
基因组
DNA
。

1.3.2 PCR
反应条件

PCR
反应体系各组分加入量
（总体积
50 μL
）
：
10×Taq Buffer 5 μL
，
10mM dNTP mixture
1 μL
，克隆引物
1
，
2
各
1 μL
，基因组
DNA 1 μL
，
Taq DNA
聚合酶
1 μL
，无核酸水
40 μL
。
采用
Biorad
的
PCR
仪，
PCR
反应参数为：
94
℃

30s
，
55
℃

30s
，
72
℃

60s
，
重复
30
个
循环后，取
5 μL
用
0.9 %
琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3
目的片段的回收

PCR
产物约
50
μ
L
，
用
1 %
的琼脂糖电泳回收目的片段。
利用
DNA
胶回收试剂盒进行
回收，方法参见
DNA
胶回收试剂盒说明书。

1.3.4
克隆载体的构建与鉴定

将回收的目的片段同载体
pMD18- T
进行连接，
具体方法按
pMD18- T
载体试剂盒说明
书进行，
构建重组质粒
pMD18- T-DERA
。
然后将重组质粒热击转化到
E. coli
JM109 < br>宿主菌
中
。
将
转
化
后
的
菌
液
涂
布
到
含
24μg/mL
异
丙
基-
β
-D-
硫
代
半
乳
糖
苷
( isopropyl-
β
-Dthiogalactopyranoside, IPTG)
、
50μg
/mL
氨苄青霉素
(Amp )
、
40μg
/mL 5-
溴
-4-
氯
-3-吲哚
-
β
-D-
半乳糖苷
( Bromo-4-Chloro-3- Indolyl-
β
-D- Galactoside
，
X-gal )
的
LB
琼脂平
板上，
37
℃
培养过夜。
利用蓝白斑筛选，
从平板上挑取白色菌落，
提取质粒后用自动序列仪
进行测序
(
由大连宝生物 公司完成
)
，并用
DNAMAN
软件分析测序结果。

1.4
酶缩酶基因的表达

1.4.1
表达载体的构建与鉴定

在
1.3.4
测序结果的基础上，设计引物
3
及引物
4
。利用引物
3
引物
4
，以
pMD18-
T-DERA
为模板扩增醛缩酶结构基因，
PCR
反应参数为：
94
℃

30s
，
54
℃

30s
，
72
℃

60s
，
重复
30
个循环后
72
℃继续延伸
10min
。用
0.9 %
的琼脂糖凝胶电泳鉴定
PCR
产物。

1.4.2
目的片段的回收：方法同
1.3.3
。

1.4.3
表达载体的构建

纯化后的醛缩酶结构基因用
NcoI
和
Sal
Ⅰ
37
℃
酶解
6h
，
用
DNA
回收试剂盒回收
684bp
的
DNA
片段。将
pET2 8b
质粒用
NcoI
和
Sal
Ⅰ
37
℃
酶解
6h
，用
DNA
回收试剂盒回收。将
回收 的目的片段和载体质粒连接，构建表达载体
pET28b-DERA
。

1.4.4
阳性克隆的筛选

将
1.4.3
中构建好的表达载体
10μ
加至
100μL

BL21(DE3)
感受态细胞中，
轻轻混匀，
在冰上静置
30min
，
42
℃水浴静止热击
90s
，迅速转移至冰上静置< br>2min
，加入
800μL
LB
培
养基，转移至
3 7
℃摇床，
250rpm
温育
60min
，使细菌复苏并表达质粒编 码的抗生素抗性标
志基因。
取适当体积已转化的感受态细胞涂布于含有
Kan
抗生素的
LB
平板上，
将平板置于