细胞周期同步化讲课稿

2021年1月21日发(作者：林钧岫)
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细胞周期同步化

在细胞培养过程中，细胞多处于不同的 细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂
活动，其余细胞分别处于
G1
、S
和
G2
各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会
影响实验的 重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大
量的处于同一细胞时期，并 可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。
细胞周
期同步化
(synchro nization)
是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋
亡，借助某种自然 或人为的实验手段
,
使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同
一时相
(
除了
G0
期的细胞
)
的现象。细胞同步化本质上包括用一定的 方法
获得一定数量的
同步化细胞群
和
使细胞进入同步化生长
的两层含 义。

DNA
合成抑制法
是通过抑制
DNA
合成将细胞同 步于同一时期的方法。
高浓度
TdR(
胸腺
嘧啶核苷
)
双阻 断法
是目前常用的抑制
DNA
合成的同步化方法。它
可逆地
抑制
DNA
合成，
而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群
阻断在
S
期或
G1 /S
交界处
。其原理是
:
Td
Ｒ是细胞
DNA
合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量
Td
Ｒ，可形成
过量
的三磷酸
腺苷，后者能
反馈抑制
其他核 苷酸的磷酸化，从而抑制
DNA
合成。它将细胞同步于
G1 /S
期交界处 ，
同步化程度高
，适用于
任何培养体系
，可将几乎所有的细胞同步化，但是< br>容易
产生非均衡生长，个别细胞体积增大
。
Td
Ｒ

双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方
面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。
羟基脲
、
5-
氟脱氧尿嘧啶
、
阿糖胞苷
、
氨甲蝶呤
和
高浓度
ADR
、
GDR
也属于
DNA
合 成抑制剂，它们与
TdR
作用相似，均可通过抑制
DNA
合成达到同步化的目 的。

中期阻断法
是利用
破坏微管
的药物将细胞阻断在
M< br>期
从而得到同一时期细胞的方法，常
用的药物有
秋水仙素
等。秋水仙素 通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，
将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到 同步化。中期阻断法
非平衡生长问题不
明显
，但
可逆性比较差
，当< br>阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂
。过去研究中也发
现，同步后的细胞的生长能力 明显不如撤去阻断剂后得到的
S
期细胞旺盛。
秋水仙胺
、
Nocod azole
也是目前常用的中期阻断剂。

经过同步化之后的细胞可以通过
流 式细胞术
对其周期进行分析
。将细胞用
PI
（碘化丙
啶）染液进行染 色，使用流式细胞仪对细胞内
DNA
的相对含量进行测定，可分析细胞周期
各时相的百 分比。由于细胞的
DNA
含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成
G1/G 0
期（
1
倍）
，
S
期（
1-2
倍）
和
G2/M
期（
2
倍）
。流式细胞仪可以
根据
D NA
含量
在不
同时间内的变化
,
从而确定细胞周期的长短
,
也可以直接
标记
DNA
复制（放射性同位素标
记）
,
统计细胞数量与标记细胞的百分比
,
对细胞周期进行综合分析
.
连续分裂 的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周
期
(cell cyc1e)
。细胞周期包含四个阶段：①
G1
期
(first gap),
又称合成前期，指前一次
有丝分裂完成到
DNA
复制前的一段时期；②
S
期
(synthesis phase),
即
DNA
合成期，为真
核细胞分裂
(cell pi sion)
间期中进行
DNA
合成的阶段；③
G2
期
(se cond gap),
为
DNA
合成
后期，指
DNA
合成结 束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④
M
期
(mitosis or pision) ,
又称
D
期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分 裂期（
M
期）和分裂间
期
(
即
G1
→
S< br>→
G2)
两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相
对而言
M
期最短，
S
期较长
。流式细胞仪（
flow cy tometer
；
FCM
）的工作原理是在样品管
中放入待测细胞，在气体的 压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单
细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔 径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中
单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指 标，在功能水平上定量分析出
其体积、内部结构、
DNA
、
RNA
、 蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞
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仪不仅可以根据不同时间内
DNA
含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放 射性
同位素标记
DNA
复制，通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测是否 达到预期
目的，从而对细胞周期各时相进行综合分析。流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比，
具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。

Hela
细胞周期时间为
21 h
，其中
G1
期
为
10 h
，
S
期
为
7 h
，
G2
期
为
3 h
，
M
期为
1 h
。

一、
S
期
同步化方法

（
胸腺嘧啶核苷双阻断法，两次可让细胞同步化到
G1/S
期
）

胸腺 嘧啶核苷
(TdR)
双阻断法：在处于对数生长期细胞的培养基中首次加入过量的
DN A
合成
抑制剂
TdR
，能可逆地抑制
S
期细胞的
D NA
生成，而不作用其他细胞阶段的运转，导致大
多数细胞群被同步化于
G1/S期交界处，但仍有部分细胞处于
S
期范围；移去胸腺嘧啶核
苷，细胞再培养一段< br>比
S
期较长而短于
G2
、
M
、
G1
三期总和的时间
，让它们完全越过
S
期，但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个< br>S
期。第二次胸腺嘧啶核苷处理，当细胞
继续运转至
G1/S
交界处时 ，被过量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。细胞则于
G1/S
期边界汇
集，再次撤掉胸腺嘧 啶核苷，加入完全培养基，使细胞继续生长，则细胞同时启动于
S
期。
5-
氟 脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度
AdR
和
GdR
等
DNA
合成抑制
剂均可抑制
DNA
合成使细胞同步化，由于
高浓度 胸腺嘧啶核苷对
S
期细胞的毒性较小
，因
此常用胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导细 胞同步化。其优点是同步化程度高，适用于任何培养
体系。几乎可将
所有的细胞
同步化 ，缺点是造成
非均衡生长，个别细胞体积增大
。

二、
M
期
同步化方法（
振荡收集法
）

该 法利用
M
期细胞变圆易脱落
的特点。在处于对数增殖期的单层贴壁细胞（分裂活跃，< br>M
期多）中加入
Nocodazole
。一段时间后，多数细胞被阻滞与
M
期，轻轻振荡或拍击培养
瓶，
M
期细胞则与瓶壁脱离，悬浮在培养液中， 收集培养液，之后再加入新鲜培养液，按
照此法继续收集，可得到一定数目的
M
期细胞 。振荡收集法操作简单，同步化程度高并且
细胞不受药物伤害，能够真实反映细胞周期状况，缺点是由于
M
期较短，被分离出的
细胞
很少
，
只能应用于贴壁细胞。收集到的有丝分裂期的细胞可以
贮存在冰上
，然后处理其余
的培养瓶。

三
.
实验用品

1.
材料：
Hela
细胞。

2.
试剂：
0.25%
胰蛋白酶液、无血清细胞培养液、
DAPI
试剂、
Hank
’
s
液、
2mmol/L TdR
、
70
％乙醇（保存于
4
℃）、
RNase-A
（
10mg/ml,-20
℃保存 ）、
PI
（
650 g/ml
，避光保存于
-
20
℃）、
PBS (pH 7.4
保存于
4
℃
)
、秋水仙胺、秋水仙素。

3 .
器材：培养瓶、移液器、枪头、
5ml
注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液器 、
Tips
、烧杯、废液缸、细胞培养设备、倒置显微镜、台式离心机、水浴、
4℃冰箱、二氧化
碳培养箱、
N2
罐、流式细胞仪、超净工作台。

四
.
实验步骤

(
一
)S
期同步化方法（
TdR
双阻断法）

(1)
取指数生长期细胞。

(2)
第一次阻断：将对数生长期 细胞的培养基换成含
2mmol/L
的新鲜
TdR
培养液。

(3) 37
℃

、
5%CO
二氧化碳培养箱
中培养
12h

(4)
第一次
释 放
：弃去含有胸腺嘧啶核苷的培养基，用
Hanks
液对贴壁细胞漂洗
2～
3
次，并更换不含
TdR
的新鲜培养基，继续培养
16h。

(5)
第二次阻断：弃去培养液，再加入浓度为
2mmol/LT dR
的新鲜培养基，
37
℃

、
5%CO
培养
12h
。

(6)
第二次释放：重复第（
4
）步骤，此时的细胞大部分出去
G1/S
期边界，同步化细
胞随时间推移逐渐 进入
S
期。

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