女人梦见自己被蛇咬用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别

2021年1月9日发(作者：月经前白带拉丝是怀孕了吗)
用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别
近年来的研究表明，Y染色体上锌指结构基因(zinc-finger-Y gene，ZFY)是继 SRY之
后又一与性分化有关的单拷贝基因，并与精子的发生有关
［1，2］
。为此， 我们利用巢式PCR
［3］
技术，以ZFY作为检测指标，参考有关文献自行设计内外两侧两对 巢式PCR引物，对绒
毛、羊水和孕妇外周血标本进行ZFY基因的特异扩增，初步建立了一种用PCR 技术产前检测
胎儿性别的方法。

1 材料与方法
1.1 标本

取正常男、女外周血各20份，每份0.5ml。孕10～32周妇女外周血31份，每
份6ml，流产胎儿绒毛45份，羊水40份，均为本科收治患者。分别采用绒毛染
色体核型、 羊水染色体核型、引产和出生胎儿生殖器检查确定胎儿实际性别。

1.2 模板DNA的提取
1.2.1 外周血细胞DNA的提取
(
1)将6ml EDTA抗凝血离心 5000rmin×3分钟后弃血清；(2)加入等体积破红细
胞液〔0.32molL蔗糖，10mm olL Tris-HCl(pH7.5)，5mmolL CaCl
2
，1%tritonX-100〕充分裂解红细胞，离心5000rmin×3分钟，重复2次；(3)沉淀物加1
0 0μl白细胞裂解液〔50mmolL KCl,10mmolL Tris- HCl(pH8.3)，1.5mmolL M
gCl
2
,0.1%明胶，0.5% NP40〕混匀后加入蛋白酶K5μl(30mgml)，置50℃消化2
小时，95℃加热10分钟， 置-20℃保存备检。
1.2.2 绒毛及羊水DNA提取
参考文献［4］的方法，所 有标本均进行巢式PCR扩增，随机取20例绒毛标
本进行斑点杂交。

1.3 ZFY基因的引物设计及扩增

根据ZFY全基因序列，G+C比例和次级结构设计的巢 式PCR实验用的外侧特异性
引物选在ZFY基因区2125～2145位及2458～2478位，引 物序列分别为P1：5′
-CCATTTGTTCTAAGTCGCCA-3′，P2：5′-CTTC AAGGCCAACATCAGCTG-3′，扩增产物
长354bp。内侧特异性引物选在ZFY基因 区2149～2169位及2435～2455位，引
物序列分别为：P3：5′-CTCTCAGT- TCACACAAAGG-3′，P4：5′-GCTTGTA-GACAC
ACTGTTAGG-3′ ，扩增产物长307bp。上述引物经计算机模拟核酸杂交软件辅助
分析与美国Gene Bank基因 数据库比较表明，与人体基因组和其它生物基因组无
明显同源性，引物碱基与靶基因一致，自身无发卡结 构，无互补结构。PCR条件
参数见本实验室已建立的HPV- PCR试验
［5］
。

1.4 斑点杂交

样品配制：DNA液20μl，0.4molL NaOH, 20μl，20×SCC 40μl，混 匀后加样
于硝酸纤维素薄膜上，使用PCR扩增片段内一段特异性寡核苷酸作探针，探针序
列为 ：TTCATACAAA-AGACTATCCTCATCGGTG，探针标记采用随机引物法，杂交步骤
参见文献［4］的方法。

2 结果
2.1 扩增片段的序列分析


用1.5%低溶点琼脂糖凝胶回收354bp和307bp扩增片段，经Sephaglas band p
rep kit抽提后，乙醇沉淀干燥，参照Sequi Therm TM循环测序试剂 盒说明进
行Sanger双脱氧终止法“直接序列测定”
［6］
，测序引物为PCR引 物。测序反应
产物经Sephedex G-75离心层析柱纯化后，在Bio-rad DNA序列仪上，以6%聚
丙烯酰胺凝胶，50℃ 50W电泳，-20℃放射自显影24小时。测序的自显影结果
如图1所示。


图1 ZFY基因PCR产物纯化后直接核酸序列分析的放射自显影图

结果所测得序列与文献报道完全一致。ZFY基因354bp及307bp扩增片段核酸序
列：


TCGACTACAACCGGAACTTC(虚线为巢式PCR外侧1对引物， 实线为巢式PCR内侧1
对引物)

2.2 PCR特异性及敏感性实验

20例正常男性用内外侧引物均有扩增带，而女性均无扩增条带；45例绒毛标本
中，21例有 特异性扩增带，有无扩增带的标本之比为1∶1.143，接近实际出生
胎儿的性别之比；40例羊水标 本中，18例判定为男性，随后与临床实际出生的
胎儿性别对照均符合。以男、女混合DNA为模板，加 入的模板量依次为：男性D
NA女性DNA：0.5μg0.5μg、0.25μg0.5μg、0.0 25μg0.5μg、0.01μg0.
5μg、0.005μg0.5μg，巢式PCR扩增均显示了 特异性307bp扩增带。

2.3 孕妇外周血胎儿细胞的检测

3 1例孕10～32周妇女外周血及羊水PCR检测，其中男性胎儿19例，女性胎儿1
2例。12例女性 胎儿经外周血直接巢式PCR分析均未检出ZFY基因。对19例怀
男性胎儿妇女同一个体不同孕周连续 采血发现，随着孕龄的增加，胎儿ZFY基因
的检出率逐渐升高，且当在某一孕周检出胎儿ZFY基因后 ，以后各孕周均可检出
ZFY基因。31例用孕母外周血胎儿细胞检出ZFY基因的孕周及例数分别为， 孕1
0周6例，孕11周11例，孕12周15例，孕13周15例，孕14周16例，孕1
5 周17例，孕16周18例，孕17周18例，有1例直至孕32周仍未检出。因此，
31例男女胎儿性 别鉴定的总准确率为96.8%(3031)

2.4 斑点杂交

结果与PCR结果相比较，二者完全一致。

3 讨论



SRY是位于Y染色体短臂1A1A区的睾丸决定子，已有文献报道用Y染色体特异
性DNA片段作为引物进行胎儿性别的鉴定，以及用相应引物进行X连锁遗传病的
检出
［2］< br>。但这种直接扩增母血中胎儿细胞DNA进行产前诊断常出现一些假阳性
和假阴性结果。究其原因 ，除各种情况导致的污染、方法条件不当外，母血中胎
儿细胞DNA的含量达不到一般扩增条件所要求的 最低模板量也是重要原因。为了
在母血中富集到足够数量的胎儿细胞以提高检出率，马旭等
［7 ，8］
利用密度梯度离
心结合CD71单抗流式细胞术对多核细胞及富集后低密度细胞中的胎儿 细胞SRY
基因的诊断率可达93.2%，但步骤繁杂费时，常需特殊仪器，且因人类Y染色体
上一些重复顺序与常染色体存在一定程度上的同源性
［7］
，易出现假阳性干扰。Z
F Y基因是Ao等
［1］
首次报道的性别决定基因，位于Y染色体短臂的Ucdo43区，
目前越来越多的证据表明ZFY是继SRY之后又一睾丸决定子(TDF)候选基因之一。
我们使用计 算机模拟核酸杂交软件程序，明显提高了ZFY基因引物设计的特异性
和实验的成功率，节省了人工选择 引物的时间，并避免了假阳性结果的出现。进
一步采用巢式PCR以提高检测的特异性和灵敏度，这种Z FY检测系统可检出1×
10
5
女性细胞中的1个男性细胞，6ml孕母外周血大约有 1～6个胎儿细胞存在，
足以满足PCR模板量的要求。对扩增片段的序列分析及40例正常男、女外周 血
DNA标本扩增，结果表明了其特异性很强。在45例绒毛DNA扩增阳性与阴性之
比为1∶ 1.143，此比例也接近实际自然出生胎儿性别之比。敏感性实验也表明，
当将男、女性DNA混合时 ，当模板中只含有1%男性DNA时(此时相当于男性细胞
数500余个)，仍可得到理想的扩增带。1 9例怀男性胎儿的妇女外周血中有18
例检出了ZFY基因，在对12例怀女性胎儿的妇女外周血进行Z FY基因检测时，
未见假阳性结果出现，提示该法对孕母外周血胎儿性别鉴定是可行的。对于本研
究出现的1例假阴性结果，推测可能与孕母外周血中尚未出现胎儿细胞或其含量
未达到检测水平有关， 尚需连续动态观察以明确胎儿细胞最晚进入母血循环的时
间并注意个体差异，从而使阴性结果的判断更为 可靠。

本课题由山东省自然科学基金(9648)资助
作者单位：250031济南，济南军区总医院妇产科(周宁、陈君、黄海士、克
丙申)；
山东医科大学基础医学院生理教研室(于萍)，附属医院妇产科
(江森)

参考文献
［1］Ao A, Erickson RP, Winston RM, et ription of paternal Y linked
genes in the human zygote as early as the prenudeate stage. Zygote, 1994,2
(4)∶281-287.
［2］Reynolds R, Varlaro J. Gender determination of forensic samples using P
CR amplification of ZFYZFX gene sequence. J Forensci Sci, 1996,41(2)∶279-
286.
［3］Kao SM, Tang GC, Hsieh TT,et is of peripheral blood of pregna
ncy women for the presence of fetal Y chromosome-specific ZFY gene deoxyri
bonucleic acid sequence. Am J Obstet Gynecol, 1992,166(2)∶1013-1019.
［4］Sambrook J, Frotsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:A laboratory man
ual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989,463-472.
［5］周宁，于萍，徐增祥.宫颈癌组织中乳 头瘤病毒感染及抑癌基因p53突变的
检测.第二军医大学学报，1997，18(5)∶443-44 5.
［6］兰风华，梅田真郎，井上圭三.单克隆抗体可变区基因PCR产物的直接测
序.上 海免疫学杂志，1996，16(1)∶10-12.
［7］马旭，张思仲，罗安雪，等.孕妇血中胎 儿细胞在产前诊断中的初步应用：
胎儿SRY基因的鉴定.中华医学遗传学杂志，1995，12(5) ∶265-268.
［8］马旭，张思仲，赵丽.孕妇血中胎儿细胞性质和来源的研究.中华医学杂志 ，
1995，75(10)∶631-632.