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郑州耳蜗找到了发酵法生产维生素c

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2020-11-22 14:28

昆明安琪儿试管婴儿领军安琪儿-如何快速缓解痛经

2020年11月22日发(作者:鲍楚翘)
《发酵工艺学》课程论文
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发酵法生产维生素C
张晓伟
食品学院
陈国刚
石河子大学食品学院
食品加工与安全




























发酵法生产维生素C
摘要:维生素C又称L-抗坏血酸是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素。抗坏血
酸在 大多的生物体可借由新陈代谢制造出来,但是人类是最显著的例外。最广为人知的是缺
乏维生素C会造成 坏血病。在生物体内,维生素C是一种抗氧化剂,保护身体免于自由基的
威胁,维生素C同时也是一种辅 酶。其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。维生素C为酸性己
糖衍生物,是稀醇式己糖酸内酯,Vc主要来 源新鲜水果和蔬菜,是高等灵长类动物与其他
少数生物的必需营养素。Vc有L-型和D- 型两种异构体,只有L-型的才具有生理功能,还原
型和氧化型都有生理活性。 其结构是一种含有6个 碳原子的酸性多羟基化合物,分子式为
C6H8O6,分子量为176.1。天然存在的抗坏血酸有L型 和D型2种,后者无生物活性。维生
素C是呈无色无臭的片状晶体,易溶于水,不溶于有机溶剂。在酸性 环境中稳定,遇空气中
氧、热、光、碱性物质,特别是由氧化酶及痕量铜、铁等金属离子存在时,可促进 其氧化破
坏。氧化酶一般在蔬菜中含量较多,故蔬菜储存过程中都有不同程度流失。但在某些果实中含有的生物类黄酮,能保护其稳定性。维生素 C 是生命的必需营养元素, 具有多种生理功
能, 因而改进维生素 C 生产工艺、提高产品产量和质量成为目前维生素 C 研究的热点。目
前, 国内维生素 C 最主要的生产方式是二步发酵法。本文对维生素 C 二步发酵法的生产过
程及目前对这一生产工艺改进的主要技术措施和研究方向作一介绍
关键词:维生素C 生产工艺 二步发酵法 主要技术

























前言
维生素 C 是简单结构的有机化合物,与单糖有密切关系。研究表明植物中含有抗坏血酸
氧化酶,能催化维生素 C 氧化,维生素 C 广泛分布在植物组织中,新鲜水果及蔬菜中含量
尤多。多数哺乳类和禽类也都能由葡萄糖合成足够数量的 L-抗坏血酸。但人、豚鼠、猴子、
蝙蝠、某些爬行动物及大多数人工养殖的鱼类甲壳类体内缺乏古洛糖 酸内酯氧化酶, 不能将
古洛糖酸内酯转化成 L-抗坏血酸,不能生物合成维生素 C, 动物体内贮藏维生素 C 量不大,
它们必须经常从环境或食物中摄取维生素 C 补充。维生素 C 广泛存在于新鲜水果及绿叶蔬
菜中,尤以猕猴桃、板栗(生)、草莓、橘子、刺梨及辣椒等含量丰富。中 草药如醋柳果、
苍耳子等也含有很多维生素 C。
维生素 C 纯品为白色单斜晶 系的结晶或结晶性粉末,无臭味酸,久置色微黄。易溶于
水,略溶于乙醇,不溶于乙醚、氯仿。它是一种 不饱和的多羟基六碳化合物,以内酯形式存
在,在 2,3 位碳原子之间烯醇式羟基上的氢可游离出来,故具有酸性。维生素 C 具有很
强的还原性,故极不稳定 ,容易为热或氧化剂所氧化,在中性或碱性溶液中尤甚;光、微量
重金属(特别是 Fe2+、Cu2+)或荧光物质(如核黄素)更能促进其被氧化。微量金属元素
对维生素 C 的氧化分解的催化作用,以铜离子为甚,其顺序为 Cu2+>Co2+>Mn2+>Zn2+
>Fe2+。在低于p H5.5 的溶液中,维生素 C 较为稳定;所以提取维生素 C 时,草酸和偏
磷酸是较好的稳定剂
维生素C的发酵 是指通过发酵作用将原料转化为维生素C,再通过生物分离技术将其从
发酵液中分离提纯,获取满足要求 的维生素C产品。维生素C的发酵过程中包含菌种的培育、
菌种的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵 环节的控制和染菌及防治六个方面。概括地说,
在发酵的整个过程中要选育出优秀的发酵菌种并采取合理 有效的方法予以保藏,保持其优良
性状;在实际生产时要对菌种进行扩大培养,满足生产上对发酵菌的数 量要求;对于发酵还
应全面的考虑发酵的消耗、产率问题,并通过适当的控制方法提高效率;染菌和污染 是发酵
过程中的一个非常严重的问题,需要严格控制,频繁检测确保发酵罐安全,避免或较小损失。
v C自四十年代开始工业化生产,其生产技术是德国人R eichstdn于1933年发明的(简称 莱
氏珠),即以0 一山梨醇为原料,经过醋酸菌发酵生成山梨糖,再经过酮化、化学氧化 和水解
得 到2一酮基一L一古龙酸,再经化学转化得到v C.其工艺比较复杂,而且消耗大量苯、丙
砚和发烟硫 酸等易燃易爆和有毒原料,此法至今仍被延用。维生素 C 是生命的必需营养元
素, 具有多种生理功能, 随着维生素 C 实验应用范围的增加, 市场需求量日益增大, 人们
对维生素 C 实验生产技术不断进行研究改进。维生素 C 实验的生产技术经历了浓缩提取、
化学合成和生物发酵三个阶段。以前, 维生素 C 实验是从柠檬、辣椒等天然植物中提取的,
价格昂贵且生产量低, 远不能满足市场需求, 现已退出工业生产。化学合成法主要是莱氏
法, 该法工艺路线成熟,原料简单易得, 产品质量好收率高, 但此法工艺路线长, 难以连续
化操作,且需耗费大量有毒、易燃易爆的化学药品, 既危险又污染环境。微生物二步发酵法< br>具有工艺路线短、“三废”少、原料单耗低和对设备腐蚀性小等优点。本文就微生物二步发
酵法合 成维生素 C 实验的生产工艺改进过程及新的研究方向作介绍。
1 Vc的性质、功能和用途
1.1 性质
纯Vc在常温下为无色晶体,味酸,易溶于水。Vc在结晶状态尚稳定,而在水 溶液中则很不稳
定,容易为加热、氧化所破坏。L_抗坏血酸具有较强的还原性,在体内经抗坏血酸氧化 酶的作
用可脱氢氧化成L_脱氢抗坏血酸,该脱氢反应是一个可逆反应。还原型的L_抗坏血酸和氧化< br>型的L_脱氢抗坏血酸均具有生理活性,它们构成的一对氧化- 还原系统,在细胞代谢中起着
重要的生理作用。
1.2 功能与用途
Vc在人体中 具有广泛的生理作用:1参与体内氧化还原反应;2对抗自由基损伤;3改善机
体免疫功能;4参与胶原 蛋白和细胞间质的合成;5参与神经递质的合成;6参与氨基酸代谢与
铁代谢;7抑制血小板及白细胞活 化;等等。因此,Vc在坏血病、感冒、心血管缺陷、高胆固
醇、糖尿病、精神抑郁症、危重型克山病等 疾病的临床治疗中均具有重要的用途。此外,Vc
还可以用作食品添加剂、饲料添加剂、某些农作物的催 熟剂、化妆品工业防锈剂,等等。
2 Vc的生产技术
2.1 生产工艺方法的演变过程
2.1.1浓缩提取
本世纪的二、三十年代,人们对于维生素 C 的结构、性质还不了解, 获取其产品的途
径只是经验性地由富含“还原性因子”的生物组织如柠檬、胡桃、野蔷薇、辣椒、肾上腺 等
提取获得。此法生产成本高,产量有限,远远不能满足人类社会日益增长的物质需求。直至
五 十年代,仍有企业使用此法生产维生素 C。
2.1.2 化学合成
1933 年,Reichstein 等和 Ault 等两个研究小组分别独立发表了维生素 C的合成方
法。从 1937 年开始,以 Reichstein 和 Grussner 的发明为基础,建立了以 D-葡萄糖为
原料,加氢还原成 D-山梨醇,然后利用一步发酵方法和化学方法合成维生素 C 的“莱氏法”
(Reichstein Procedure),维生素 C 生产开始进入化学合成阶段。“莱氏法”生产的工艺
流程主要包括以下五个步骤:
1)D-葡萄糖在镍的催化作用下,高温高压,加氢还原成 D-山梨醇;
2)D-山梨醇经微生物如生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter melanogenus)
或弱氧化醋酸杆菌(Acetobater suboxydans)发酵氧化成 L-山梨糖;
3)L-山梨糖在丙酮和硫酸的作用下,经酮化生成双丙酮-L-山梨糖
(Diacetone-L-sorbose 简称双酮糖),生产上俗称丙酸化。再用苯或甲苯提取,
提取液经水法除去单酮山梨糖后,蒸去溶剂而后分离出双酮糖;
4)双酮糖在高锰酸钠氧化,铂催化下,经水解生成 2-酮基-L-古龙酸
(2-Keto-L-gulonic acid);
5)2-酮基-L- 古龙酸通过烯醇化和内酯化,在酸性或碱性条件下,转化生
成维生素 C。
莱氏 法生产的Vc产品质量好、收率高,而且生产原料(葡萄糖)便宜易得,中间产物(如双
丙酮_L_山梨 糖)化学性质稳定,但是莱氏法也存在着不少缺陷,诸如生产工序繁多、劳动强度
较大,容易造成环境污 染,等等。为此,自上世纪60年代起,各国学者一直致力于莱氏法的改
进[7,20],并取得了很多 成果,有的已用于Vc工业生产实践。
2.1.3微生物发酵法
六十年代以后,各国生产企 业及科学家开始探索以细菌生物酶转化的方法来取代“莱氏
法”,相继提出了诸多反应路线,并在此基础 上对有关反应工艺的问题进行了探索。已成功
应用于大生产的细菌发酵法是我国七十年代初开发的“二步 发酵法”。 由中国科学院微生物
研究所、北京制药厂、东北制药总厂尹光琳、宁文珠等人发明的“二步 发酵法”从七十年代
后期开始正式投产,逐渐在国内生产企业普遍采用,现在国内四大维生素 C 生产企业都采
用此法。二步发酵法生产维生素 C 的新工艺 1980 年获得国家级二等奖。“二步 发酵法”已
经在中国、欧洲、日本和美国申请了专利,上海三维制药有限公司当时具有坚实的科研开发< br>力量,1985 年成功地将维生素 C 二步发酵技术转让给 F Hoffmann-la Roche
Ltd.,Switzorland(瑞士豪大迈- 罗氏公司),成为建国以来最大的一项医药技术出口项目。
该法应用于大生产初时,从 D-山梨醇到维生素C 的总收率平均为百分之四十多,但经过近
几年的激烈市场竞争后,一些厂家可超过百分之六十五,最高为 72%。“二步发酵法”的工
艺路线与“莱氏法”不同之处在于采用大、小混合菌发酵法代替化学法转化 L-山梨糖合成 2-
酮基-L-古龙酸。简化了生产工艺,减少了生产设备投资,降低生产成本,去除 了大量有机
溶媒等有毒物品的使用,极大地减少了“三废”的排放。
2.2微生物发酵法的研究进展
严格地讲,二步发酵法也是一种半微生物发酵半化学合成方法。该工艺方法的发酵原料
仍为D-山梨醇, 而非葡萄糖;并且,第二步发酵过程中涉及2株菌的混合发酵,其详细消长机
制尚未完全明了。这些都需 要人们进一步研究和探索。
2.2.1二步发酵法
“二步发酵法”是唯一应用于大生产化的细菌发酵途径。采用生物技术进行发酵生成维
生素 C 的重要中间体 2-酮基-L-古龙酸的工艺,使我国二步发酵法处于世界领先水平。目
前,通过细胞固 定化,原生质融合,遗传工程等新技术的使用,如中国科学院等离子体物理
研究所采用离子束注入技术作 为新诱变源筛选出 2-酮基-L-古龙酸高产菌系 IPPM-1028、中
国科学院沈阳应用生态研究所的新型微生物蛭弧菌 J26转化山梨糖生产 2-酮基-L-古龙酸
发酵条件的研究,使“二步发酵法”工艺研究更加具有国际先进水平。“二步发酵 法”经过
的是L一山梨糖途径,即D一葡萄糖加氢生成的D一山梨醇先经细菌转化为L一山梨糖,后者< br>再经过细菌发酵生成维生素C前体一2一酮基一L一古龙酸(2一keto一L一gulonie一
aeid,ZKLG)。这两步反应是在不同微生物’一t’进行的。
2.2.1.1 大、小菌的相互关系
二步发酵法的第二步发酵是采用大菌、小菌2株菌的混合发酵过程,2株菌缺一不 可。
Vc工业生产中常采用的小菌为氧化葡萄糖酸杆菌,大菌为巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或
条纹假单孢杆菌。研究发现,在大、小菌的混合培养中,两者的增殖是同步进行的。小菌是
2- KLG合成的主体,大菌一方面直接参与2- KLG的合成过程,一方面对小菌的生长起促进作
用[6]。小菌合成的2- KLG对大菌的生长增殖有明显的抑制作用,而大菌的存在却是小菌的
生长增殖和合成2- KLG所必需的[12]。深入研究发现,大菌的胞内液和胞外液均可促进小菌
的生长,大菌胞外液中 具有该作用的组分的分子量在100kD以上。此外,胞外液还具有促进小
菌转化I-山梨糖生成2- KLG的作用,具有该作用的组分包括30- 50kD和大于100kD两部分,
其中前者系一种含铁 和锌的蛋白质[13]。目前,这方面研究仍在继续。
2.2.1.2 新菌种的选育
优良的菌种对于Vc产量和经济效益的提高具有特殊重要意义。焦鹏等(1997)[14]运用
SMA 探针技术与HB- HG影印技术筛选得到了一株蛭弧菌J26,摇瓶发酵产生2- KLG的发酵单
位为50- 60mgml。通过优化发酵条件,该菌株的发酵单位已达到83.9- 91.7%[15]。许安等
(1998)[16]利用离子注入技术选育出的2- KLG高产菌系IPPM- 1028的山梨糖转化率比由氧
化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌组成的出发 菌系高出18.8%。摇瓶发酵试验表明,该菌系的
发酵周期为60_64h,2_KLG浓度可达76 gL[17]。陈建华等(2002)[18]筛选得到的优良伴生
菌———短小芽孢杆菌(Bacil lus pumilus)与氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵生产2_KLG的山梨
糖转化率高达90%。尹 光琳等(1997)[19]选育得到的新组合菌系SCB329_SCB933的发酵周期
仅为40_ 50h,2_KLG的发酵单位高达115- 130mgml。
2.2.1.3 工程菌的构建
为了克服传统二步发酵法的缺点,人们开始尝试构建优良的产2- KLG工程菌。工程菌的
构建主要建立在人们对二步发酵法菌种相关关键酶的研究基础之上。
1974年,Markover等提出了微生物合成2-KLG的山梨酮途径学说,认为L-山梨糖在微生
物体内先由L-山梨糖脱氢酶(SDH)催化生成I-山梨酮,尔后再由L- 山梨酮脱氢酶(SNDH)催化
生成2- KLG。后来,人们从氧化葡萄糖酸杆菌、生黑葡萄糖酸杆 菌等中陆续分离纯化出了SDH。
研究发现,SDH的分子量为46- 60kD,系一个典型的米氏酶,对L-山梨糖的Km值为5.27× 10-
2 molL。SDH的活力与2- KLG的合成呈正相关,伴生菌的存在能提高SDH的比活力。Shinjoh
等(1994)首先从液化醋杆菌中克隆了SDH基因和SNDH基因。关于SDH、SNDH及其编码 基因
的研究为构建优良的产2- KLG工程菌奠定了基础。1998年,Saito等将SDH基因和 SNDH基
因导入氧化葡萄糖酸杆菌,结果发现,转化菌株的2- KLG产量比出发菌株有较大提高。这方
面研究尚待继续深入。
2.2.2 葡萄糖直接发酵法
国外较早就开始了细菌串联发酵葡萄糖产生2- KLG的研究。我国的尹 光琳等(1987)采
用欧文氏菌和棒杆菌以葡萄糖为发酵原料串联发酵产生2- KLG获得成功。后 来,她们又通过
原生质体融合技术得到了欧文氏菌和棒杆菌的融合细胞。摇瓶发酵试验表明,细胞融合所 得
的38株融合子中约有40%能将葡萄糖转化成2_KLG。氧化葡萄糖酸杆菌与棒杆菌的休止细胞< br>共固定化串联发酵葡萄糖产生2- KLG工艺的最高转化率达到37.72%。
1985年,Anderson等将棒杆菌的2,5-酮- D-葡萄糖酸(2,5- DKG)还原酶基因转入 欧文
氏菌,所得工程菌的葡萄糖转化率可达到47.7%。后来,又有一些学者进行了类似试验,并取< br>得初步成果。但是他们所获得的工程菌都存在着一定的问题,因此至今未见到用于生产实践
的报道 。
2.2.3 2- KLG的分离提纯
二步发酵法两次发酵以后,发酵液中仅含8%左右的2- KLG,而残留菌丝体、蛋白质、多
糖或悬浮微粒等杂质的含量却很高。这给2- KLG的分离提纯带 来了很大困难,致使后处理费
用占总成本的比例较大。目前,Vc工业生产中常用的2-KLG的分离提 纯方法有:1加热沉淀
法;2化学凝聚法;3超滤法。
2.2.3.2 化学凝聚法
同加热沉淀法相比,化学凝聚法采用化学絮凝剂沉淀各种杂质,从而避免了前者能耗较
多的问题。季光 辉等(1997)研制的新型化学絮凝剂能使Vc的总收率提高2.5%。张秋荣等
(1999)通过摸 索絮凝处理的最佳条件,使2-KLG的提取收率比加热沉淀法高出4.49%。但是
发酵液经化学絮凝 剂处理以后,离心所得的上清液中仍含有一定量的蛋白质等杂质,这些杂
质可能影响2- KLG的质量。此外,该方法所使用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。
2.2.3.3 超滤法
超滤法是一种新兴的膜处理技术。由于该方法在提高2- KLG收率、改善生产环境、减
少离 子交换树脂损耗、实现自动化连续化生产等方面具有明显优势,因此在2- KLG分离提纯
中的应用日 益广泛。1995年,我国的东北制药厂从丹麦引进了目前全国最大膜面积的平板超
滤装置。采用这套设 备后,2- KLG的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了600万元,并
且大大提高了2- KL G的收率和生产的自动化、连续化程度[34]。但是超滤法也具有一定的
缺陷。例如,设备一次性投资 较大,超滤装置的通量、抗污染能力尚待提高,等等。目前,国内
外学者正在探索反渗透、纳滤等新的超 滤法工艺。
2.2.4 2- KLG的化学转化
由于至今未能找到使葡萄糖直接发酵产生 Vc的微生物菌种,因此发酵产生的重要中间
产物2-KLG必须通过化学方法转化成Vc。根据所用化 学试剂不同将化学转化方法分为酸转
化法和碱转化法。由于前者所用的浓盐酸对设备腐蚀较严重,且易造 成环境污染,因此逐渐为
后者所取代。碱转化法的2- KLG转化率可达到92.6%,并且操作简便,对设备的腐蚀较轻,所
以适于Vc的规模化生产。
2.2.5 2- KLG废液处理
二步发酵法发酵液经分离提纯后,仍含有大量的2- KLG。如果将其直接排放,不仅浪费
了宝贵的2- KLG资源,而且会对环境造成严重污染。王辉等 (1998)运用离子交换树脂处理废
液,可大大降低其中的杂质(如色素)含量,从而从废液中再结晶 出2- KLG合格产品。王燕等
(1999)则对利用2- KLG废液生产草酸进行了小试和中试。
3 结语
目前,维生素 C 混合生产菌的基础研究中,由于二步发酵混合大小菌株的作用关系还
没有较科学论证,混合菌发酵 L-山梨糖生成 2-酮基-L-古龙酸的机制只有宏观的研究,在
工业化生产中,糖酸转化率受培养外 界环境因子的影响很不稳定,因其内在微妙机制还没有
研究成果,这给稳定单罐糖酸转化率的高水平带来 困难。外界环境因子的进一步优化组合技
术对工业化生产的进一步发展显得尤其重要。Vc用途广泛,是 我国医药出口创汇的最重要产
品之一。大力提高Vc的生产技术水平,提高Vc产品的产量与质量,降低 生产成本,不仅有利
于我国Vc生产工业的发展,而且对整个国民经济都具有积极的作用。从技术上讲, 根据目前
国内外Vc工业生产的现状,我国应注重以下几个关键问题:
3.1 利用基因工程等先进手段选育优良的微生物菌种
二步发酵法是我国Vc工业生产的当家工艺方 法。然而,该方法涉及二步三种菌,操作工
序繁琐,菌种传代困难,不能直接把葡萄糖作为发酵原料。如 果能选育出直接以葡萄糖为发酵
原料的优良菌株并应用于生产实践,那么无疑会对Vc生产工业带来巨大 的推动力。理论分析
和初步实验证明,上述设想是切实可行的。在长期的菌种选育实践中,基因工程这一 新兴技术
显示出良好的应用前景。今后,应当广泛采用基因工程等先进手段,争取早日选育出适于Vc< br>工业生产的优良菌种。由于“二步发酵法”的现有转化率己经达到相当高的水平,因此想继
续提高 Vc的生产效率应该筛选新的菌株,来简化现有的生产工艺。
3.2影响发酵工艺的因素
微生物发酵是一个极为复杂的生化反应过程。基质、温度、等因素对微生物的代谢以及
菌体生长和产酸的 形成都会产生影响。维生素“二步发酵法”是我国独特的生产工艺,技术
路线成熟,工人操作熟练,发酵 产率和产品质量均己达到国际水平。但维生素C“二步发酵法”
过程十分复杂,干扰因素多,再加之生长 自动化、连续化程度差,因而造成生产稳定性不够,
劳动生户;率较低。此外由于发酵基质浓度低,设备 利用率差,这就导致工厂的生产成本偏高。
为了解决以上问题,对该发酵工艺动力学的研究是非常必要的 。邵军等和魏东芝等分别于
1989年和1992年报道了对维生素c二步发酵过程动力学的研究。他们 通过测定发酵体系中
大小菌生长规律,以及基质和产酸的变化,建立了简化的动力学模型,不仅从一定程 度上揭示
了ZKLG发酵系统的本质特征,而且可用于分析发酵过程并指导生产。同时,动力学模型的建
立也为维生素C二步发酵生产实现连续自动化奠定了理论基础。近年来国内部分科研单位和
制药 厂对于第二步发酵混合菌株的生长和代谢关系作了多方面的探讨,并己在生产上应用。
根据混合菌株各自 生长周期不同的特点,摸索了混合菌株在发酵中的产酸规律。为了阻止2
一酮基一L一古龙酸继续代谢生 成副产物,在发酵过程中严格控制pH值并及时终止发酵过程,
以达到最大的产酸量。
3.3不断优化Vc发酵生产条件
大量的文献及研究工作中表明,要想再进一步大 幅度提高产品质量或收率在后工序工艺
流程中潜力已经不大。对当前的维生素 C 工艺流程进行分析研 究,今后工作应该加大发酵
提炼工艺流程研究,特别是二步发酵菌种的开发研究。应用基因工程技术开展 对菌种的基因
测序,实现发酵基因工程菌生物酶的糖酸或醇酸专一性转化更强,为今后的重点工程。发酵
过程直接关系着Vc工业生产的优劣成败。在利用基因工程等先进手段选育优良的微生物菌
种的 同时,必须注重配套的发酵工艺条件研究。以往有关此类研究的报道较少[11],高密度发
酵过量合成 2- KLG或Vc、补料发酵、利用计算机对发酵过程进行多变量模拟和优化、重新
筛选优质廉价的发 酵原料取代山梨醇等先进的发酵工艺在Vc工业生产中的应用几乎未见诸
报道。今后,应当注重Vc发酵 工艺条件的优化研究,以大幅度提高Vc的产量、质量和经济效
益。
参考文献

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本,韦庆昆,吴克文(译),食品工业出版社,北京:1956,20-92


























































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