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口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程
口服脊髓灰质炎活疫苗系用具有高度抗原性的 脊髓灰质炎
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型减毒株，分别接种于猴肾或人二倍体细胞培养制成
的单价或三价液体疫 苗。用于预防脊髓灰质炎。
A
、猴肾细胞脊髓灰质炎活疫苗
1
毒种
1.1
毒种来源
可用
Sabin
株，
Sabin
纯化株，中Ⅱ17，中Ⅲ2
株。所有疫
苗生产用毒株均须经卫 生部批准。
1.2
毒种批
1.2.1
毒种批制备与保存
毒种批用原毒株在猴肾细胞或人二倍体细胞上制备。
从原 毒
株算起，SabinⅠ、Ⅱ型、中Ⅱ17
及中Ⅲ2
型传代次数均不得超
过< br>3
代，
Sabi
nⅢ型不超过
2
代。
所有毒种均应于
-
60℃以下保存。
1.2.2
毒种批检定
每一毒种批均按
A3
项分批检定（滴度不得低于
6.5LogPFU/1.0ml）。
2
疫苗制备
生产用房应为独立的单元，
不得 携入或操作强毒株或其他病
毒、致病菌。生产前，应对生产区进行消毒。
工作人员必 须经过专业培训，
身体健康，
并服用脊髓灰质炎
活疫苗。每年生产前应进行体检。传染 性肝炎、痢疾、活动性肺
结核患者不得进入生产部门。在猴区工作的人员不得患有肺结
核。
2.1
猴肾细胞制备
2.1.1
动物选择和检疫
用未做过其他试验或做过本疫苗检定的健康猕猴制备细胞
培 养物。所用动物隔离检疫应不少于
6
周，应无结核、
B
病毒感
染及其 他急性传染病。凡有严重化脓灶、赘生物以及明显的肝、
肾病理改变者不得用于制备疫苗。
2.1.2
细胞消化与培养
采用电磁搅拌或灌注法以胰蛋白酶或其他分散 剂消化猴肾
细胞。细胞培养瓶置
37±0.5℃培养，应于
9
天内长成单层。 每
只猴所获细胞为一个细胞批。
可把原代猴肾细胞连续传
5
代后，用于接种病毒。
2.2
病毒接种、培育与收集
细胞维持液含
3.0
～
5.0g/ L
碳酸氢钠（
pH7.6
～
7.8
）。病毒
接种量为
0.01
～
0.5MOI
，
种毒后置
33±0.5℃培养，
出现完全病
变时间应在
40
～
96
小时。
病毒液按细胞批收集于大瓶中，澄清过滤。
2.3
病毒液合并或浓缩
病毒液合并或浓缩时可用
0.2
μ
m
的滤膜过滤。
2.4
加氯化镁与分批
病毒液加氯化镁，最终浓度为
1mol/ L
（
pH6.8
～
7.2
）即为
液体疫
苗。
同日制备的病毒液为一个亚批，数个亚批组成一个疫苗批，
批量一般不 超过
40
万
ml
。
2.5
分装
半成品经检定合格后分装即为液体疫苗成品。
3
检定
3.1
猴肾细胞外源因子检查
3.1.1
对照细胞检查
于接种病毒当天（
0
天），每批猴肾细胞留取
10%
～
25%
换维
持液，作为正常细胞对照，以检查外源因子。
该细胞瓶置
33
～35℃培育，观察
14
天，以此期间检查细胞病变。有疑似病毒存在者，用猴肾细胞传代，传代后仍有类似现
象，
该细胞批所制疫苗应废 弃。
用于传代的猴肾细胞应设细胞对
照。
3.1.2
血吸附检查
种毒后
7
天，检查对照细胞中血吸附病毒。通常用0.2%
～
0.5%
鸡、豚鼠红细胞（储存于
2
～8℃不超过< br>7
天），分别放
4
～
8℃、
20
～25℃30
分钟观察结果，
应为阴性。
如血吸附可疑阳性，
在同种细胞上继续盲传，
如 传出病毒，
该批细胞制备的疫苗应予
废弃。
3.1.3SV40
及其他外源因子检查
当日生产猴肾细胞批同时接种小方 瓶数个做外源因子检查，
于种毒
0
～
2
天，将细胞上清混合液接种于 对
SV40
病毒敏感的
Vero
细胞瓶中，
混合液在培养液中的含量 应不少于
20%
，
同种细
胞最少留一瓶以上不接种，作为细胞对照，观察14
天。于接种
后
5
～
8
天，再把上述细胞培养的上清 液盲传一代，传代后观察
14
天。
3.2
病毒液检查
3.2.1
外源因子检查
样品以脊髓灰质炎病毒型特异性抗体（该抗体不 能用猴制
备，免疫用抗原必须用非灵长类细胞制备）或单克隆抗体中和。
中和物（可稀释，但稀 释度不应超过
1∶4）接种猴肾细胞或其
他已知对
SV40
敏感的细胞，并留 取正常细胞对照，37℃培养观
察
4
周。观察到
2
周时，用同样细胞 再传一代，并观察
2
周。观
察期满因其他原因剔除不能观察的细胞瓶数不大于
20%
，本试验
为成立。如培养物发生病变，应查清原因。如证实该病变是由于
未中和 的脊髓灰质炎病毒引起的则须重试。
如证实病变确系
SV40
或其他外源因子污染所致 ，
并证明与病毒液有关，
则该批病毒液
应废弃。
3.2.2
无菌试验及支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。支原体检查使用已证实< br>支持需固醇和非需固醇支原体生长的液体和固体两种培养基。
3.2.3
病毒滴定
用微量细胞病变法或空斑法在猴肾或
Hep-2
或其他敏 感细
胞上进行。培养温度为
35
～36℃，病变法
7
天判定结果，空 斑
法
4
天判定结果。病毒滴定时应设病毒参考品。
3.2.4
型特异性检定
取Ⅰ、
Ⅱ、
Ⅲ型单价或三价脊髓 灰质炎病毒抗血清与等量样
品混合，
置
37℃中和
1
小时，
接种猴肾、
Hep-2
或其他敏感细胞，
7
天判定结果。样品应为单价病毒液 ，型别正确无误。
3.2.5
家兔试验
经
3.2.1
～
3.2.4
项检定合格的样品，每瓶等量取样合并。
如果不立即进行检定， 样品应保存于
-
20℃以下。
样品应进行猕猴疱疹病毒（
B
病毒）和其他病毒检查。用体
重为
1.5
～
2.5kg
的健康家兔 最少
5
只，每只家兔注射的样品量
不少于
10ml
，用其中
1ml
进行皮内多点注射，其余的进行皮下
注射，观察时间不少于
3
周。到期 动物死亡数不得超过
20%
。无
B
病毒和其他病毒感染判为合格。
家兔在试验
24
小时以后死亡，疑有
B
病毒感染时作尸体解
剖检查，
取部分神经组织及脏器标本冻存待查。
同时用脑细胞制
成
10%悬液，以同样方法接种
5
只家兔，证实有
B
病毒感染时，
应终止 生产并报告国家检定当局，未采取措施防止再感染之前，
不得继续生产。
3.2.6
猴体试验
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