(完整版)放射性碘标记

2021年3月2日发(作者：吲哚美辛栓)
放射性碘标记


在
RIA
中，标记抗原质量的优劣，直接 影响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原，并
保持免疫活性不受丧失。




一、同位素的选择



同位素有 稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量，这种测量较灵
敏而方便，故 多用放射性同位素。标记抗原，常用的放射性同位素有
3
H
、
14
C
、
131
I
和
125
I
等。在使用上各
有 其优缺点，可根据所进行的放射免疫分析的类型特点，标记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作
适 当的选择（表
8-1
）。大多数抗原分子中都含有
C
、
H
等 原子，所以用
14
C
或
3
H
标记不改变抗原的结构
及其免疫学活性，且
14
C
、
3
H
半衰期长，所标记的抗原 长时间放置后仍可使用，这都是其优点。
14
C
或
3
H
标记 的不足之处是操作较繁琐，并难以获得高比放射性的标记物；
3
H
及
14C
放出的都是弱
β
射线，需用较
昂贵的液体闪烁计数器方能获得较高效率 的测量，且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易
丧失免疫化学或生物学活性者，则仍以采 用
3
H
或
14
C
标记物为佳。

表
8-1
标记抗原常用的放射性同位素及其性质

射线种类及能量（百万电子伏特）

放射性元素

半衰期

β



γ

－

－

0
．
035
0.364
，
0.637
，
0.722
14
C
5720
年

12.5
年

60
天

8.05
天

0.155
0.0189
－

0.608
，
0.335
，
0.250


3
H
125
I


131
I


大多数抗原分子中是不含碘的
,
引入碘原子就改变了抗原的分子 结构，
往往容易损伤抗原的免疫化学活
性；且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放 射性降低，因而需要经常制备标记物或要求能定
期提供放射性碘标记都能适用，放射性碘放出
γ —
射线，用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确
的测量，测量操作也很简单。由于这些 突出的优点，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘标记物最多。



从应 用角度来看，
131
I
和
125
I
又各有其优缺点，
可根据实验的要求、
仪器的条件和放射性碘制剂的规格
等条件合理选用。
但相对而言 ，
125
I
有较多的优点，一是半衰期适中，
允许标记化合物的商品化及贮存 应用
一段时间；二是它只发射
28keV
能量的
X
射线和
3 5keV
能量的
γ
射线，而无
β
粒子，因而辐射自分解少，
标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象（包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸
类以及环型核苷酸衍生物等）的标记，且操作简单，一般实验室都不难做到。




二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记



要制备高比 度、高纯度与免疫化学活性好的标记物，首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放
射标记加网免疫 分析的特异性，
所以若用纯度不高的抗原作标记，
则标记后必须采取适当的步骤除去杂质，以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法，否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质（这时表面上活性可能还是良好的），再经标记反应时所受的损伤，活性就会显著降低，影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原，还要采用适当方法加以标记，尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。



多肽激素与蛋白质多用碘标记，
最常用的是
125
I< br>。碘化反应的基本过程如下：
通过氧化剂的作用，
使碘
化物（
125< br>I
-
）氧化成的碘分子（
125
I
2
），再与多肽激 素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不
管采用哪一种放射性碘标记法，标记的化合物内部 必须有碘原子可结合的基团，即结构上要含有酪胺基或
组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原，在结构上含 有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述
基团的，放射性碘无法标记，必须在这些化合物的 结构上连接上述基团后才能进行碘标记。



因此影响蛋白质、多肽碘化效 率的因素，主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在
分子结构中暴露的程度；此外，碘 化物的用量、反应条件（
pH
、温度、反应时间等）及所用氧化剂的性质
等也有影响。



常用的标记方法有：



（一）氯胺
T
法



氯胺
T
法 标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。



1
．原理氯氨
—
T
（
Chloramine--T
）是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化
成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪 氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸
的多肽链。




2
．方法以
125
I
—
AVP
的制备为例。




（
1
）碘化反应：
AVP5μg+0.5mol/l
PB50μl
（
pH7.5
）
+
125
1800μCi,
混合后 ，加入新配置的
Ch
—
t
30
μg/15μl(0.05mol/l
PB,
pH7.5)
。迅速振荡混匀，室温下反应
40s
。



（
2
）终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠
40μg/20μ l(0.05mol/l
PB,
pH7.5),
以终止碘化反应。



（
3
）
Bio
—
Gel
P
2
层析纯化：将碘化反应混合液注入
Bio
—
Gel
P
2
柱，用
0.1n
HAC
溶液洗脱，分部
收集 ，每
2min
收集一管，共收集
60
管。


< br>（
4
）放射性测量：测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一峰为
125I
—
AVP
，第二峰为游离碘盐峰。
第一个峰中计算最高的几管，留下备 用。



为了解标记抗原的质量，每次碘标记后应计算出碘的利用率，标记 上多少放射性碘，以及每微克抗原
结合上多少放射性碘。



（< br>5
）标记抗原的贮存：经纯化与检查后的标记物、加入
1/8
体积的异丙醇，分 成若干小份，置于铅罐
中，在
-20
℃
以下的冰箱中贮存备用，应避免反复冻 融。标记抗原在贮存中是不稳定的，这是因为：一是脱
碘，标记的碘从原来位置上脱落，变成游离碘；二 是蛋白损伤、变性，成为聚合大分子或断键成小分子碎
片。由于上述原因，使
B/F
明 显降低，标准曲线斜率变小，以致不能使用，故需分离纯化，其方法是用
S
ephadex
G100
长柱（
40
～
80cm
）过柱，洗脱后出现3
个峰。第
1
个峰分子量大，是蛋白变性的聚合的
大分子，尚保留部分抗 原决定簇，免疫活性弱；第
2
个峰是纯抗原的蛋白峰，免疫活性好；第
3
个峰 是游
离
125
I
或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第
2个纯抗原蛋白峰，免疫活性好；第
3
个峰是游离
12
5
I
或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第
2
个纯抗原蛋白峰，其性能类似于新鲜标记的抗 原。分离
纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题，特别对来之不易的抗原更显得重要。



2
．注意事项



（
1
）放射性碘源的选用：无载体的
131
I
或
125
I均可用于碘化标记，但应尽量选用新鲜的、比放射强度
高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比 放射强度最好
≥50
～
100mCi/ml
，至少也要
>30mCi /ml
，否则
加入碘源的容量要增加，随着带入碘源中含有的还原剂（为放射性碘源运输保存所 需加入）量也增加，这
将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。
放置较久和放射性碘源，
一方面因衰变致比放射强度降低，
另一方面因水的辐射化学产物增多（主要是
131< br>I
源），都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂
（如
Na
2
S
2
O
5
等）量多时，会抵消氯胺
T
的作用，降低 碘利用率，甚至导致标记完全失败。放射性碘源要
用无载体的，标记所用全部用具和试剂必须不含碘；只 要有极少量的碘的污染，非放射性碘就会稀释放射
性碘，使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防 护和除污染，以及减少射线对蛋白质分子的损伤，
标记投入的放射碘量不宜过大，一般以
<5m Ci
为宜。



（
2
）放射性碘与多肽、蛋白质 用量的比例：这比例对标记结果的影响很大。如上述原因，一般标记时
放射性投入量不宜过多，示踪实验 室中常规每次只用
1
～
2mCi
，因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值< br>主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时，多肽、蛋白质用量多（即
I/
多

肽、蛋白质比值低），能获得高碘利用率，但所得标记蛋白比放射强度低； 相反多肽、蛋白质用量少（即
I/
多肽、
蛋白质比值高）
，
则碘利用 率降低，
但所得标记多肽、
蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动；
而当此比值< br><1
后，则碘利用率再下降的幅率较小，标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。



（
3
）氯胺
T
与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反 应时间：氧化碘化标记法中，会导致失活的最主要原因
是氧化还原。
氯胺
T
是 氧化剂，
早期用氯胺
T
法作碘化标记时氯胺
T
用量都比较大，
或碘化反应时间较长，
结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺
T
用量大，或长 时间进行碘化反应，结果并不能使碘利用率
和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少，反而使标记多肽、 蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很
少的放射性碘源时，试以各种蛋白质（包括白蛋白、球蛋白、
ACTH
、胰岛素等）作微量标记，当氯胺
T
用量为
20μg/0. 1ml
反应液、
0
～
20
C
反应
20s
，
碘利用率都已接近或达到最大峰，
再加大氯胺
T
用量和延
长反应时间 是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多，氯胺
T
用量也应增加，以达到预期的碘利用率，< br>但决不应盲目加大氯胺
T
用量和延长碘化反应时间
（通常反应时间不要超过1min
）
，
否则会导致标记多肽、
蛋白质严重失活，不能用于实验。当 然，减少氯胺
T
用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上，否则
碘源中还原剂量较 多，双盲目减少氯胺
T
用量，就会使标记失败。一般用
125
I
标记 时，氯胺
T
用量要适当
加大。加入氯胺
T
后必须迅速混匀，以防标记 不均匀。氯胺
T
与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。

。


氯胺
T
用量减少了，
Na
2
S
2
O
5
用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应，实验时加入
Na
2
S
2
O
5
一般都是过量的。氯胺
T
用量大时，加入
N a
2
S
2
O
5
的剩余量也就会随之增加，这就可能加重某些 对还
原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此，
Na
2
S
2< br>O
5
用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是
新配的，以重量计算
Na
2
S
2
O
5
加入量与氯胺
T
相同就足 以保证终止碘化反应（按反应克分子浓度计算，
N
a
2
S
2
O
5
/
氯胺
T
重量比约
0.4
），不要盲目加大用 量，并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来，
以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。



某些蛋白质或多肽对氯胺
T
较敏感，
还可进一步减少氯 胺
T
用量、
缩短碘化反应时间、
降低反应温度，
以保护蛋白质的活性 。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。



（
4
）碘化反应体积：系指加入
Na
2
S
2
O
5< br>终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小，局部反应物浓
度愈高，所得碘利用率和标记多肽、蛋 白比放射强度就愈高。所以，标记应采用比放射标记效果。当反应
液量少（
<0.2
～
0.3ml
）时，反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大；当反应
液量大（
>0.5
～
1.0ml
）时则影响较小。微量氯胺
T
法放射碘标记时，一般多控制碘化反应体积
<100μl
。



（
5
）碘化反应温度：温度升高，碘化反应速度加快，碘利用率有所增加。 但总的来看，反应温度的影
响不很大，一般从
0
到
20
℃
碘 利用率相差不过百分之几，故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复
性好的结果。有些蛋白质或肽类 极易丧失活性，则可在
0
℃
进行碘化反应。

℃


（
6
）
碘化反应的
pH
值：
受氧化剂氧化生成的活 性碘，
对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用，
最适
pH
是
7 .3
～
7.8
之间。
当
pH
变化时，
碘化位置也会 发生变化，例如
pH
值较高时，组氧酸的咪唑环也
可被碘化；当
pH4
～
5
时，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚，导致肽链断裂。这些都会影响蛋白

质或多肽的放射性碘化反应，或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时，除放射性碘源外，所有 的试
剂都应用适当的缓冲液配制，保证碘化反应在最佳
pH
条件下进行。



（
7
）微量蛋白质或多肽的吸附损失：界面的吸附损失，在使用 大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的，
但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫 微克水平，界面吸附导致的损失就不能
忽略。例如制备
131
I
—
A CTH
时，所用
ACTH
浓度低到
50Pg/ml
时，因表面吸附可 损失
10%
～
30%
，甚至
高达
75%
。改变pH
、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时，能减少吸附，但不能完
全 消除。
一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的
2%
～
8%、
残留在层析柱上折占
5%
～
10%
。
残留量随标记蛋 白比放射性强度而直线增减，残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见，微量蛋白质或多
肽受吸附而损失 的量是不容忽略的。
由于微量蛋白质、
多肽会被显著吸附而丢失，
所以标记时投入蛋白 质、
多肽量过微（如
<2μg
）也是不适宜的，否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低 ，并在计算上会造成较大的
误差。



（
8
）不 同蛋白质、多肽碘化标记的差别：由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同，而
且其空间结 构也不相同，分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应，有的就不容易碘化，因此同样条件
下进行碘化 标记，不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的
情况也各不 相同。例如
ACTH
、促性腺激素释放激素（
GRH
）、促黄体激素释放激素 （
LRH
）等多肽，碘
化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性；而
A FP
及人绒毛膜促性腺激素（
HCG
）等的碘化标记，
则较容易保存良好的免 疫化学活性。



尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别，但上述 讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的
影响有共同的规律。掌握了这些因素，就容易成功地获得合格 的标记物。



不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同，放射 碘化标记反应后，可根据具体情况采取不
同的方法将标记蛋白质（或多肽）与未反应的游离放射性碘及受 损伤的标记物分开，常用的方法有凝胶过
滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。



（二）乳过氧化物酶法（
LPO
）



本法反应温和，
对抗原、
抗体免疫活性影响小，
已被广泛应用。< br>缺点是标记率较低，
一般为
20
～
40%
。



1
．原理此法是利用乳过氧化物酶（
Lactoperoxid ase
）有促进微量过氧化氢对
125
I
-
的氧化作用，生成
1
25
I
+
，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。



2
．方法以标记蛋白质抗原为例。



（1
）反应液组成：蛋白质
2
～
5
μg
溶于磷酸缓冲液< br>10
～
25μl
中，加入
Na
125
i
1m
Ci(10μl)
、乳过氧化
物酶溶液
25ng(10μl)
、
H
2
O
2
200ng(10μl)
；




（
2
）在室温保温
7min
；


（
3
）加入
H
2
O
2
200ng(10μl)
；



（
4
）过
7min
再加 入
H
2
O
2
(3μl)
；



（
5
）保温
7min
后，加入
0.5ml
、
10mmol/L
巯基乙醇以停止反应；



（
6）
10min
后加入
NaI
载体溶液
1ml
；



（
7
）按常规方法分离纯化。



3
．注意事项



（
1< br>）
LPO
质量好坏，可直接影响标记率，
LPO
应在使用前新鲜配制， 以防酶活性降低。



（
2
）
LPO
用 量应小于总蛋白质用量的
1%
，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。



（
3
）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。



（
4
）碘化反应在
pH4.0
～
8.5
较宽范围内均可进行，最适
pH
值应依据蛋白质本身性质而定。



（
5
）
H
2
O
2
应保持低浓度，如高于< br>0.1mmol/L
，对酶的活性将有抑制作用。



（三）
Iodogen
碘化法



此法具有标记 率高、反应体积小（
3ml
水平）、可用低浓度的
125
I
原料、对 多肽激素和蛋白质的免疫
活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。



1
．
原理

用
Iodogen
为氧化剂 ，
对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，
把
125
I
直接引进分子中的 酪氨酸
残基上。标记过程中被标记样品不与
Iodogen
混合，标记后取出样品即停 止反应，不使用任何还原剂。



2
．方法



（
1
）标记之前，先把
Iodogen
溶于有机溶剂，涂 于管底，并使之干燥。



（
2
）标记时，将蛋白质溶液
10
～
20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)
置于反应 管中，反应管置于冰浴中。
碘化时，
125
I
与蛋白质克分子之比例为
1
～
1.2
。反应时间在温和的连续的搅拌下可达
10min
，从 反应管中
转移出反应混合液，使其反应停止。反应液转移到含有
200μl0.01mol/L
、
pH7.2PB
和
0.15mol/L
NaCl
溶液中，层析分离前再放置
5min
，使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲 液的柱中使白蛋白
碘化。




3
．注意事项



（
1
）涂有
Iodogen
的反应管，有氮气中密封，并贮存在
-20
条件下，至少可用
3
个月。打开管，使
用时间很短。

℃


（2
）碘化反应时间，
7min
时标记率达最高，
10min
时略 有减少。
PH6.0
～
8.5
时，标记率最高。



（
3
）
Iodogen
与蛋白质的比率是标记率的函数。 最大的标记率是
1
克分子的
Iodogen
与
8
克分子或< br>再多量之比。



（四）酰化试剂（
Bolton
和
Hunter
试剂）法



1
．原理这个方法用酰化剂
3--
（
4-羟苯基）丙酸
—
N
琥珀酰胺酯（
Bolton
—
Hun ter
试剂）做连接试剂，
将
125
I
标记在羟苯基的
2< br>，
5
位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将
3--
（
4
—
羟基
—
5
—
125
I
—
苯
基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。



2
．方法
125
I
—
Bolton
—
Hunter
试剂可用氯胺< br>T
法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使
用时取一定量的标记酯（
μmol
蛋白用
3
～
5μmol
标记酯），用氮气吹除苯，投入 欲标记蛋白
5
～
10μg
及
缓冲液
10
～
50μl,pH8.0
～
8.5
为宜，在冰浴中反应
15
～
30min
后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量
标记酯消耗掉以终止反应。



此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止 碘源中有害物质对
蛋白质的损伤，
适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，
引入碘原子后会引起蛋白质的失活。
其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应 ，碘标记率比较低。一般认为此法不宜
标记短肽，而适于分子量大于
1
万的蛋白质。< br>


三、放射性标记化合物的纯化与鉴定



（一）纯化标记化合物的常用方法



不论使用何种制备方法，要 获得合格的标记化合物，都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外，
一些标记化合物，经过一定时间 的存放后，往往会出现不纯物，而需再纯化。如碘标记生长激素（
125
--HG
H< br>）
,
在刚标记的第
2
天，
从
Sephadex G-100
过滤谱上可见，
几乎所有的碘化
HGH
都集中在峰
I I
；
保存
1
个月后，峰
II
组份减少，峰
I
和峰
III
成分明显增加，峰
I
是集聚的标记生长激素，而峰
II I
是不具有免疫活
性的放射性化学杂质（图
8--3
）。