-
分离培养:
无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中,
置
37
℃
恒温箱
中培养
24
小时,
长
成绒毛样菌丝,未见其它细菌生长。经
48
小时培养长成白色菌落。
72
小时菌落呈纽扣状,
由中心向外周 逐渐变深,转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。
通常 人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌,
霉菌只是众多
真菌 中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成,
按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微
生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的
两种 说法。
真正真菌包括霉菌,
霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成 ,
按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深< br>部真菌,包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为
细胞真 菌的一种,也为深部感染真菌,包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等,常发生于
免疫力低下的患者, 引起全身播散性感然,影响预后。
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定 。目前国标方法中使用的培养基有
:
马
铃薯葡萄糖琼脂
(PDA),
孟加拉培养基
(RBC)
、高盐察氏培养基
(CAO),
其中
PDA
和
RBC
适合
于一般的霉菌和酵母菌生长
,
而
CA O
则适合于高渗性霉菌生长
,
酵母菌几乎不长。
在日常检测
中我们发 现
,
有些常见的耐高渗性霉菌
,
如局限曲霉、
谢瓦曲霉、
赤 曲霉、
Wallemia
等在
PDA
、
RBC
上生长非常缓 慢或不长
,
而这些菌在高渗培养基如
M40Y
、
DG18(M40Y
琼脂配方
:
蔗糖
400g,
麦芽提取汁
20g,
酵 母提取汁
5g,
琼脂
20g,
氯霉素
50mg,
蒸馏水1000ml;DG18
琼脂配
方
:
葡萄糖
10g,
蛋 白胨
5g,KH2PO41g,MgSO4·
7H2O 0.5g,
氯霉素
0 .1g,0.2%
二氯硝基苯胺
1.0mL,
琼脂
15g,
蒸馏水< br>1000mL,PH6.5)
上则正常生长
,
孢子、
形态特征发育良好
,
而且酵母菌
也能在
M40Y
、
DG18
上生长< br>,
因此
,
若能同时采用
PDA
和
M40Y(
或
DG18)
分离培养各类样品
中的霉菌
,
将能更全面地反映出污染 霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品
等
,
更有必要同时采用
M40Y
或
DG18
。
由于霉菌中很多种类 不会产生有毒的霉菌毒素
,
危害较小
,
而有的菌株即使污染数量不
多
,
但其产生的霉菌毒素却危害较大
,
因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害 程度
,
重要的
是要知道污染菌的菌相
,
才能更好地判断被污染食品的 安全程度。为此
,
国外有些研究者设计
出各类选择性培养基
,
可以识 别产毒的霉菌。如
AFPA
培养基
(
配方
:
酵母提取汁20g,
蛋白胨
10g,
柠檬酸铁铵
0.5g,0.2%
二氯硝 基苯胺
1.0mL,
琼脂
15g,
蒸馏水
1000mL,PH5.6 )
用于分离
黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。
产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉 在
AFPA
上
30
℃
培养
2~3
天就形成背面有亮 橙黄色的特征性菌落
,
非常容易识别。有人利用该培养基分离黄
曲霉高污染食品花生、
玉米等
,
取得了满意的结果。
因此
,
针对不同样品
,
有目的地设计出相应
的选择性培养基
,
以筛选污染菌中的危险菌群
,
将是一个值得探索的方向。
2
接种方式
接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法
,
但近来 国际上有不
少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。
Beuchat
和
Mat suda
等人分别对这两种方法作了大
量比较试验后发现
,
对霉菌计数来说< br>,
涂抹法有以下几方面优越于倾注法
:
①
培养出的霉菌菌
落数 较多
;
②
培养所需的时间较短
;
③
霉菌孢子、
菌落 形态特征发育完全
,
便于鉴定。
这是因为
绝大多数霉菌是好氧的
,< br>在培养基表面生长快
,
发育好
,
而混在培养基中发育就受影响
,
而且在
培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。我们在自己的实验室也做了类似的比较试验
,
通过对
30
种常见霉菌的试验证实了上述的结论。因此
,
我们认 为
,
霉菌计数采用涂布法既准确又省时
,
值得推广。
3
培养温度
经对多 种常见霉菌的最适生长温度作了调查发现
,
大部分菌种的最适温度为
25~30
℃
。
但一些产曲霉毒素的菌株或动物致病菌则需要更高的温度
,
如黄曲霉< br>35
℃
、构巢曲霉
33
℃
、
烟曲霉
37℃
、小孢子菌
35
℃
。因此
,
培养温度也应根据培养目 的而定
,
一般情况下都采用
25~28
℃
培养
,
若 有特殊培养目的
,
则应适当调节培养温度。
4
培养时间
我们对
30
种常见霉菌的生长速度 作了调查
,
正常培养条件下
,
培养
3~4
天的菌落数与5~7
天的基本相同
,
但菌种的特征不明显
,
因此
,< br>如果只要作霉菌计数
,
培养
3~4
天已基本达到
目的
,
但如果还要进一步分类鉴定
,
则需要培养更长的时间
(7~14
天
)
。必须特别注意的是
,
有
几类生长特别快、菌丝很多的菌
,
则必需在
48
小时以内计数
,
否则菌丝就会覆盖整个平皿
,
无
法准确计数。这类菌主要有
:
毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度 较大的样品
,
这类菌
污染较多
,
检测这类样品
,
应 提早观察记录。
5
最适计数范围
霉菌菌落由孢子和菌丝组成
,
相当扩散
,
在直径
9cm
的 平皿里
,
菌落数稍多就相互交叉重
叠
,
影响计数
,
但数量太少又会产生较大的误差
,
因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确
的关键环 节之一。我们对这方面作了一些观察研究
,
首先是将实验菌株的斜面培养物制成含
有约
106
个
/ml
的孢子悬液
,
并用血球计数器在显微镜下准 确计数
,
然后将饱子悬液作
10-1~10-6
倍稀释
,
吸 取不同稀释度的稀释液接种于
PDA,25
℃
培养
5
天后计数。30
种常见
霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示
,
大部分菌株每平 板含有
10~50
个菌落的稀释度
时的计数与显微镜计数结果最接近
;
有近一半的菌株
,
每个平板含
50~100
个菌落已较难计数
,< br>而大部分菌株
,
超过
100
个
/
平皿或小于
10
个
/
平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差
别
,
因此
,
应尽量选择
10~50
个
/
平皿的稀释度进行霉菌计 数。而对上述提及的菌丝很丰富、
菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株
,
则应在 更少的范围内计数
(30
个
/
平皿以内
)
。为
控制 霉菌的生长速度和菌落的生长范围
,
可在培养基中添加少量抗生素
,
如氯霉素
(50~100mg/L),
金霉素
(20~100mg/L),
庆大霉素< br>(50mg/L),
土霉素
(100mg/L)
等。
6
霉菌检测过程中应特别注意的事项
6.1
由于霉菌检测所需的时间较长
,
中间又需要多次 观察
,
因此实验前一定要作好实验
计划
,
明确观察记录的时间。
6.2
霉菌孢子通过空气传播
,
所以 实验时应保持实验室平静
,
减少空气流通
;
操作时手脚
要快
,
动作要轻
,
特别是培养过程中
,
如果观察时动作过大
,< br>早期生长出的霉菌孢子就会在培养
基内扩散
,
形成新的菌落
,
导致结果不准确。
6.3
实验前应认真做好全面的 消毒工作
,
包括操作人员手指、实验室空间、实验台等
,
实验后应第一时间将 有霉菌的培养物高压灭菌
,
防止进一步扩散。
6.4
对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解
,
并作好相应
的防扩措施
,
防止污染其它物品。
3.2.1
涂片镜检分别取
l5
羽鸡肺部或气囊有结节
的病料,将结节用
2
片载玻片压碎后分开,再用镊子
调匀,革兰氏染色后盖上盖玻片,置高倍镜下观察。
结果在暗视野下可见到大量的分隔菌丝,
气囊上的
结节除可见到菌丝外,
还可以见到散在的蓝色球状
孢子。
3.2.2
分离培养挑取典型病变结节接种于血液琼
脂平板培养基上,置于
37
℃温箱中培养。
24 h
后可
见到小米粒大小的白色绒毛状菌落,
48 h
后菌落增
大,
60 h
后转为淡绿色,
72 h
后菌落转为暗绿色,一
个星期后呈黑褐色
[4]
。用接种环挑取菌落涂片镜检,
可见到曲霉菌的形态结构(菌丝有隔,末端膨大成球
状,球上有小梗,有的梗上有孢子存在,状如花冠)
,
符合曲霉菌的特点。
根据实验室检查结果再结合病史调查、现场观
察、临床症状及剖检变化,可确诊为禽曲霉菌病。
(一)直接检查
是最简单而重要方法,浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑
置玻片上,滴加
10%KOH
,覆盖玻片微热熔化角质层,再将玻片压紧,用吸水纸吸 去周围
多余碱液,
在显微镜下观察,见皮屑甲屑中有菌丝,或毛发内部或外部有成串孢子,即可 初
步诊断为癣菌感染,
但不能确定菌种。
深部感染真菌标本如痰,
脑脊液亦可 做涂片用革兰氏
染色(白色念珠菌)或愚汁负染色(隐球菌)观察形态特征。
(二)培养检查
本法可确定
菌种,辅助直接检查不足,通常用沙保氏培养基 (
22
~
28
℃)
,深部真菌可用血琼脂或脑心
葡萄糖血琼 脂
37
℃培养,或根据不同菌种运用不同培养基,如孢子丝菌可用胱氨酸血液葡
萄糖琼 脂,
必要时运用鉴别培养基和生化反应,
同化试验等进行鉴定。
(三)
免疫学试验
近
年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体 ,
作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、
念珠菌、
曲霉
菌。但系统性感染患者常因免疫 功能降低不出现抗体;而且许多真菌间抗原性有交叉反应;
有的产生抗体后维护时间较长,
正常 人群中有一定比例的阳性率,
则必须结合临床情况分析
结果才能作出恰当的诊断。
< br>由于上述检测抗体受到许多因素的限制,及深部真菌感染时,
早期培养阳性率甚低,
晚期 则多于失去治疗时机,
因此用免疫学方法从血清或其他部位检测
真菌抗原,
对早期诊断 具有重要意义。
如乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原,
ELISA
法检 测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶
性抗原等,均为早期,快速 、特异的诊断方法。
(四)动物试验
其些真菌对实验动物有致
病 性,
如皮炎芽生菌,球孢子菌可在小白鼠,
豚鼠体内生长,
白色念珠接种家兔小白鼠可 发
生肾脏脓肿致死。
四、防治原则
真菌感染尚无特异预防,主要 注意公共卫生和个人卫生,
碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效。制霉素、灰黄霉素、克霉唑( 三苯甲霉唑)
等外用或内服过癣症和白色念珠菌病等有较好疗效。近年服道
5-
氟胞嘧 啶(
5-FC
)治疗单
细胞真菌感染疗效显著。二性霉素
B
可用于深 部全身真菌感染。
玻片培养又称小培养,
小培养法 可以随时观察真菌的生长形态
(如大分生孢子、
小分生
孢子及孢子柄等)
,还 可以随时观察其生长发育的全部情况,有利于菌种的鉴定。
1
、钢环法
(
1
)材料:白假丝酵母菌、沙保弱培养基、玻片培养又称小培养,小培养法可以随时 观察
真菌的生长形态
(如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等),
还可以随时观察其生 长发育的
全部情况,有利于菌种的鉴定。
1
、钢环法
(
1
)材料:白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环(带有缺
口)、
石蜡。
(
2
)方法
①用无 菌镊子取无菌小培养钢环,
环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡,
平置于无菌载玻
片上,
另取一无菌盖玻片,在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上,
待冷后,
小培养钢圈即被< br>固定于载玻片与盖玻片之间。
②用毛细滴管吸取融化的培养基,从钢环上端孔注入, 注入量占容积的
1/2
即可。
③培养基冷却凝固后,用接种针挑取材料,由上端孔接种于环内培养基上。
④置湿 盒内,室温或
37
℃下培养
2
—
3d
后,逐日观察,镜下可 连续看到真菌生长过程
及菌丝、孢子等特征,一般
7d
左右即可长好。
< br>⑤也可不用小培养钢环,
直接将融化的培养基滴于无菌玻片上,
待冷凝后从周边接种材< br>料,用盖玻片覆盖后培养,在显微镜下连续观察生长情况。
(
3
)结果:镜下观察可见到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌丝。
2
、小块琼脂玻片培养法
用无菌操作法将制好的待用琼脂平板用无菌接种 针或接种环切成大约
1cm2
的方块,将
其放置于灭菌的载玻片上。
将标本或 待检菌接种于琼脂块四周边缘靠上方部位,
然后用无菌
镊子取一无菌的盖玻片盖在琼脂上。在无 菌平皿内放入少量无菌水和一个无菌
U
形(或
V
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