血培养

2021年3月2日发(作者：樟脑球有毒吗)

临床微生物实验室血培养操作标准


1
范围





本标准规定了血培养标本临床微生物检验的技术要求。




本标准适用于开展血培养的临床微生物实验室。


2
术语








一套血培养：从同一穿刺点同时采集的血液标本，分别注入需氧和厌氧培养
瓶；




静脉输液缸：一种植入皮下，可长期留置在体内的静脉输液装置；




HACEK
菌群：嗜沫嗜血杆菌、人心杆菌、啮蚀艾肯菌和金氏金菌；




血培养污染率：一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、座疮 丙酸
杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。


3
导言








人体血液中有很多物质，包括溶菌酶、白细胞、免疫球蛋白、补体等，可在
几分钟内将入侵血流的微生物 清除。
当微生物感染超出人体免疫系统的防御能力
时，
人体将不能将微生物局限于原始 感染的部位，
或在治疗中不能通过切除、
引
流等措施清除感染源，那这些微生物将侵入 血液迅速繁殖形成菌血症或真菌血
症。
一过性菌血症常发生于对感染病灶的外科处理、
黏膜的创伤操作和易污染的
外科手术，
亦可发生于感染性心内膜炎等血管内膜感染以及伤寒和波 浪热的最初
几周。菌血症是临床急症，应尽快采集血液进行培养。血培养是对入住急诊科、
IC U
患者、
移植患者以及静脉插管患者的败血症进行早期诊断的一种方法，
并根
据阳性血培养病原菌的药物敏感性试验，
可为临床医生提供最佳的抗菌药物治疗
方案，
对降低病死率有很大的帮助，
血培养对于临床诊断和预后评估也有重要的
意义。



4
血样采集和培养瓶接种





4.1

采血指征




可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，
可考虑采集血培养：
发热
（≥
3< br>8
℃）
或低温（≤
36
℃）寒战，白细胞计数增多（计数
>1 0.0
×
10
9
/L
，特别有“核左移”
时）或减少（计数
<3.0
×
10
9
/L
）
,
皮肤黏膜出血 ，昏迷，多器官衰竭，血压降低，
C
反应蛋白、降钙素原（
PCT
）
、
1
，
3
－
β
－
D
－葡萄糖（
G
试验）升高及突然发生
的急性呼吸、体温和生命体征改变。


1

4.2

采血时间及套数


4.2.1
采血时间










推荐在寒战或高热高峰前后采集，用抗菌药物之前采集。





4.2.2
血培养套数






应同时采集
2~3
套培养瓶，
2~5
天内无需重复采集血培养。只有在怀疑感染
性心内膜炎或其它血管内感染
（如导管相关性感染 ）
时，
才能必要间隔多次采集
血培养。对于新生儿，采集一瓶儿童需氧瓶，建议同时做 尿液和脑脊液培养。


4.3

采血量

< br>成人每瓶采血量
8~10ml
，儿童
1~15ml
，但不应超过患儿总 血量的
1
％。血
液和肉汤之比为
1
：
5
~1
：
10
。新生儿
0.5ml
。


4.4



需氧瓶和厌氧瓶间的血液分配


4.4.1

采血量充足的患者


推荐配套采集需氧瓶和厌氧瓶，将血液先注入厌氧瓶，后注入需氧瓶。


4.4.2

采血量不足的患者


应将足量血标本先注 入需氧瓶，
再将剩余血液注入厌氧瓶。
有利于分离出真
菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食 单胞菌。


4.5



血培养采集程序


4.5.1

采集血培养标本之前首 先做好手卫生。
静脉穿刺点选定后，
去除血培养的
朔料瓶帽，切勿打开金属封口环和胶 塞，使用
7
0
％异丙醇或
75
％乙醇消毒，自
然干燥
60s
；


4.5.2

在穿刺前或穿刺期间，防止静脉滑动，可戴无菌乳胶手套固定静脉；


4.5.3

穿刺点皮肤消毒；


4.5.3.1

三步法


1
）

7
5
％酒精擦拭静脉穿刺部位，待干
30s
以上；

2
）

1
％
~2
％碘酊作用
30s
或
10
％碘伏
60s
，从穿刺点向外画圈消毒至消毒区域
直径达< br>3cm
以上；

3
）

75
％酒精脱碘：对 碘过敏的患者，用
75
％酒精消毒
60s,
待酒精挥发干燥后

2

采血。穿刺点消毒后不可再接触。


4.5.3.2
一步法：
0.5
％葡萄糖酸洗必泰作用
30s< br>（不适用于
2
个月以内的新生
儿）
，或
70
％异丙醇 消毒后自然干燥。


4.5.4
用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头（ 如果行第二次穿刺，换针头）
，直
接注入血培养瓶，不可将抗凝血注入商品化培养瓶。


4.5.5
血液接种到培养瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固。


4.5.6

完成工作后洗手。


5


血培养瓶运送

血培养瓶应尽快送至实验室孵育或上机，
如果运送 延迟，
应在血液接种后尽
快
35
~3
7
℃孵育，切勿冷藏或 冷冻。如果病房没有孵箱，血培养瓶应置于室温，
而非冷藏或冷冻。


6
血培养标本的接受收与拒收标准


6.1
实验室工作人员在收 到标本之后应观察血培养瓶生长指示信号，如果指示
有细菌生长，则应进行涂片镜检。


6.2

血培养瓶一般不予拒收，
如发现以下情况：
血培 养瓶标识错误或没有标识，
破碎，损坏，渗漏，凝血等情况，应及时与临床联系。


7

实验室操作方法及流程


7.1
影响检出率的关键因素


7.1.1

培养基


胰酶消化的大豆肉汤（
TSB
）是应用最广泛的基础培养基，脑心浸液、哥 伦
比亚布鲁氏、硫醇

基乙酸盐和添加蛋白胨肉汤也是较常见的用于需氧菌和厌氧菌的培养基。
Middlebrook
肉汤可增强分枝杆菌的复苏能力。


7.1.2

添加剂







抗凝剂茴香脑磺酸钠（
SPS
）
，能中和溶 菌酶，抑制吞噬作用，使部分氨基
糖苷类失活，
抑制部分补体串联。
浓度为
0 .025~0.0
5
％，
有些浓度低到
0.006
％。

3

SPS
会抑制部分细菌生长，包括奈瑟菌属、厌氧消化链球菌、卡他莫 拉菌和阴道
加德纳菌。
除了营养肉汤可稀释血液以及
SPS
可降低血中抗生素 对细菌的抑制作
用外，某些血培养瓶中加入了抗生素中和或吸附剂，如树脂。抗凝剂肝素、
ED TA
和柠檬酸盐对微生物有毒性，不能用于培养瓶中。


7.1.3
孵育条件


7.1.3.1
温度：
35
~3
7
℃孵育。


7.1.3.2
气体：出厂的血培养瓶中的气压低于大气压以保证能注入足量血液。
有些手动系统，
培养瓶必须用针制造一个需氧的气体环境。
厌氧瓶顶端的气体中
含有 二氧化碳和氮气。


7.1.3.3
自动化血培养系统每间隔一定时间 检测需氧和厌氧瓶中微生物生长信
号。当有阳性信号时进行处理（详见
9
：血培养阳性 结果处理和报告程序）
。对
于已经培养
5d
的阴性瓶不需要常规盲传或终点转 种。


7.2
血培养方法


7.2.1
手工血培养


7.2.1.1
传统肉汤培养


需氧培养基：
脑心浸液肉汤、
哥伦比亚肉汤或胰酶消化大豆肉汤；
微需氧或
厌氧培养基：硫醇或硫基乙酸盐。苛氧菌培养需添加溶血素、维生素
k1
，< br>L
型半
胱氨酸。抗凝剂采用
0.025
~0.0
5
％ 的
SPS
。推荐添加树脂中和抗菌药物。肉汤的
体积为
18
~100 ml
。


7.2.1.2

双相培养基






同时含有琼脂和肉汤的血培养瓶，
可用 于成人或儿童患者的需氧菌、
厌氧菌
和分枝杆菌培养。
培养瓶需要垂直孵育，
同时观察肉汤和琼脂表面有无微生物生
长。


7.2.1.3

溶血离心法


溶血离心法是将微生物从溶解的血液中释放出来后，
通过离心将其与血液成
分分离，
因浓度不同而聚集在收集管底层的一种血培养方法。
从 溶血离心管底层
沉淀物转移至固体培养基进行孵育。


7.2.1.4

孵育时间：
手工法推荐
3
5
～
37
℃孵 育
7d
，一些缓慢生长的苛氧病原菌
（巴尔通体、
李斯特菌属、
布氏 杆菌属和奴卡氏菌属）
和双相真菌可能需要更长
的孵育时间。手工法需要每天观察培养状态，如 无生长迹象后摇动再孵育。



4

7.2.1.5

检测的频率和转种：
手工法需每天或更频繁的观察微生物肉眼可见的生
长， 应特别注意孵育
48h
内的生长迹象。检测培养时需明亮的荧光灯或白炽灯，
观察浊度 、溶血、产气、表面菌落形成和血液颜色的改变，发现有微生物生长迹
象进行涂片革兰染色和转种，根据 涂片染色结果选择培养基类型。


7.2.2


自动化培养






原理：通过电子 感应器检测微生物生长代谢的
CO
2
浓度、监测其生长。





孵育时间：
3
5
～
37
℃ 孵育
5d
，包括布鲁菌属、嗜血杆菌属、放线菌属、心
杆菌属、
埃肯菌属、< br>金氏杆菌属和营养变异性链球菌
（乏氧菌属和颗粒链球菌属）
也可检测出来。某些缓慢生 长的苛氧菌（巴尔通体、李斯特菌属和奴卡菌属）和
和双相真菌可能需要更长的孵育时间。
血培 养仪阳性报警后，
立即进行涂片革兰
染色和转种，根据镜检结果决定转种的培养基类型。

对于已使用抗菌药物治疗的患者，
建议采用含树脂等中和物质的培养瓶，
可
提高细菌的检出率、缩短检出时间。


7.2.3
真菌血液培养


7.2.3.1
危险人群


真菌血症与创伤性或消化道粘膜溃疡、广谱抗细菌药物的应用、静脉营养、
中心静脉插管和免疫 抑制剂使用有关。

血培养中最常分离的酵母菌，包括白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近
平滑念珠菌和新型隐球菌，
其它念珠菌
（如克柔念珠菌、
葡萄牙念珠菌和季尔 蒙
念珠菌）
、糠秕马拉色菌、红酵母属和毛孢子菌属分离率较低。马内菲青霉素是
最常 见的双相真菌。荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、镰刀菌、赛多
孢菌、外瓶菌、喙枝孢霉菌少 见，多在
AIDS
、血液恶性肿瘤、骨髓及器官移植
和其它严重的免疫缺陷疫病的患者 中分离出。


7.2.3.2
培养条件


酵母菌在需氧瓶中易生长。
摇动肉汤培养可提高酵母菌的检出率，
对于全自
动商品化血 培养系统或手工培养系统孵育最初
24h
的机械摇动都可实现。
多数酵
母菌孵 育
2
～
5d
可检测出，
某些酵母菌
（如光滑念珠菌和新型隐 球菌）
可能需要
延长孵育时间。糠秕马拉色菌需要在培养基中添加树脂（如橄榄油）
。 如果怀疑
双相真菌或丝状真菌感染，孵育时间可能需要延长至
2
～
4
周。


7.2.3.3
方法—手工检测法


真菌血症检测的手工培养瓶包括：
1
）营养肉汤培养瓶，
2
）双相培养瓶，
3
）
溶血离心培养瓶。
酵母菌应用这三种培养瓶都可检测出，
但是双 相真菌和丝状真
菌只能用双相培养瓶和溶血离心培养瓶可靠检测。
双相培养瓶在酵母菌、
双相真
菌和丝状真菌的培养中可以应用，
其中双相真菌需孵育
4
周时间。< br>双相培养瓶在
孵育的最初
24h
内，
应轻轻摇动。
双相真菌和 丝状真菌在溶血离心培养基中的检

5

测时间要早于其它手工血培养系统 ，
离心浓缩的血液沉淀物应接种到多种琼脂培
养基，
27
～
30℃和
35
～
37
℃同时孵育。


7.2.3.4
方法—自动化检测法







建议采用专用真菌血培养瓶，可提高酵母菌的检出率、缩短检出时间。


7.2.4
分枝杆菌血培养


7.2.4.1
危险人群



分枝杆菌血症易发生在免疫抑制患者中，如< br>AIDS
、白血病、多发性骨髓瘤
和其它恶性肿瘤、
接受高剂量类固醇激素或细 胞毒性化疗和长期的血管置管的患
者。

最常分离的是结核分枝杆菌和鸟分支杆菌复合 体。其他缓慢生长分枝杆菌，
包括堪萨斯分支杆菌、
猿分枝杆菌、
蟾蜍分枝杆菌和日内 瓦分枝杆菌也已分离到。
快生长分枝杆菌引起的菌血症（如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌）
与长时间的置留中心静脉导管和人工植入物感染相关。


7.2.4.2
培养条件


分枝杆菌不是专性苛氧菌，
如果孵育时间延长，
也能够在普通血培养肉汤中
生长。
血培养中分枝杆菌的最佳培养方式是在肉汤中添加脂肪酸< br>（如不饱和脂肪
酸）
、白蛋白和
CO
2
。分枝杆菌有些种（日 内瓦分枝杆菌和嗜血分枝杆菌）生长时
需要添加剂（分枝杆菌生长素、溶血素、血红蛋白或柠檬酸铁胺）
。由于分枝杆
菌繁殖缓慢，所有培养应至少孵育
4
～
6
周。


7.2.4.3
方法—手工检测法


血 标本在接种前，
必须通过溶血素释放细胞内的菌体。
应使用含有抗凝剂的
无菌管
(
如
SPS
、
肝素和柠檬酸盐，
但不能使用
EDTA)< br>或者溶血离心管收集。
全血
不能直接接种于不含溶血素的固体培养基或肉汤。
用 溶血离心管收集的血标本可
接种在各种固体、
肉汤或双相培养基上；
但固体培养基上培 养效果不如肉汤和双
相系统。阳性标本在双相培养系统中生长速度慢于自动化培养系统。


7.2.4.4
方法—自动化检测法


< br>自动化系统的培养基中添加了各种生长因子和抑制杂菌生长的抗菌药物。
不
同系统在检测 时间上有差别。建议采用分枝杆菌专用血培养瓶，以提高阳性率。


8
血培养安全防护



对所有标本操作都应采取生物安全防护措施，
血培养中的病原菌可能通过呼

6

吸道或直接接触污染实验室工作人员的皮肤、
眼或者粘膜引起感染。< br>另外，
工作
人员间接暴露于污染的物体表面或分离到的病原菌，
有实验室获得感 染风险，
需
要个人防护用品及微生物安全柜等设备。


8.1
实验室获得感染途径



针刺伤病毒感染、包括乙肝病毒、 丙肝病毒和
HIV
；皮肤粘膜暴露是肝炎病
毒和逆转录病毒感染的主要途径，而其它的 主要途径是气溶胶或微滴。


8.2
防护措施


8.2.1
洗手


洗手是预防实验室获得感染的关键要素。< br>在戴手套前、
摘手套后、
工作结束
后、
离开实验室和进入清洁区时，< br>都必须洗手。
如直接接触血液或任何潜在的感
染性物质后必须立即清洗暴露部位。


8.2.2
防护屏障


采集血培养时应戴手套 ，
采集下一患者时必须换手套。
血液污染手套、
有破
损迹象或失去防护作用时 ，必须及时更换。在接收和处理标本时，需要戴手套。

可能发生血液或其它感染性物质喷溅的情况下，需要面部防护。

在没有安全柜的情况 下，
血培养操作和检验时需要穿防水、
长袖、
前面封闭
的隔离服。
存 在任何可见污染时立即脱去。
污染的隔离服必须作为生物危险垃圾
丢弃或严格按流程清洗。离开 实验室或去实验室内的清洁区时要脱去隔离服。


8.2.3
生物安全柜


在处理阳性血培养瓶时，须在Ⅱ级生物安全柜中进行。


8.2.4
灭菌、消毒和去污染


采集和处理血培养标本时可能会污染仪器设备及环境 表面，
实验室操作程序
中必须包括如何防止和控制感染性物质溢洒。
运送标本的人员必 须经过培训，
运
送容器必须能够防止感染性物质溢洒和血培养瓶破损。

若溢 洒的感染性物质可经呼吸道传播，溢洒处的房间必须关闭至少
30
分钟
以上使微滴沉降 。
在清理溢洒时必须穿戴合适的个人防护装备，
包括防护服、
手
套和面罩。< br>清理溢洒物中有破碎玻璃或锐器时，
须戴防刺伤的手套。
气溶胶已经
形成或呼吸 道传播危险性高（如结核分枝杆菌）时，必须戴
N95
口罩。地面大面
积溢洒时必须穿 防水鞋。

根据溢洒物的量、
类型、
可能含有的传染性物质及其浓度和污染表 面的类型，
来制订实验室具体处理措施。一般需要包括以下要素：

?

容器及吸收物质

?

用水溶性清洁剂去除残留的溢洒物


7