血清白蛋白的分离

2021年3月1日发(作者：什么是介入治疗)













学

院
:
化学与生命科学

专

业
:
生物技术

姓

名：

管宇

学

号
: 09640129















生化大实验


























血清白蛋白的分离、纯化与鉴定

一
.
实验目的

掌握血清白蛋白分离纯化的方法；

学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质的原理与操作；

学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；

学习检测蛋白质纯度的方法；

掌握
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。

二
.
实验原理

1.
血清白蛋白的初步分离
血清白蛋白约占血浆蛋白总量的
60%
，水溶性很强，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参
与脂类代谢 及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域
应用广泛。


可以根据不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来
分离及提纯各种蛋白质。

盐析是广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐 使蛋白质从溶液
中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中
和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使蛋白质变
性，因 此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就可以重新溶解。

在半饱和硫酸铵溶液中，血清白 蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清
液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得 多，故盐析初步分离的白蛋白可用透
析法或凝胶层析法除去硫酸铵。

奈氏试剂是络盐
K2[HgI4]
加
KOH
的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵
盐


2.
血清白蛋白的纯化

离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。

本实验采用的是
DEAE
－纤维素阴离子交换剂
（中强碱型）
，
可电离基团是二乙基氨基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼
此之间相反 电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的
pH
与盐离子浓度有关。因此，蛋白质
混合物的 分离可以由改变溶液中盐离子浓度和
pH
来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋
白质首 先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后的白蛋白溶液在
0.02mol/L
pH7.4
醋酸铵缓冲
液的条件下，加到二乙氨乙基（
DEAE
）一纤维素层析柱上，在此
pH
时，
DEAE
一纤维
素 带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、
α
及
β
球蛋白（血清白蛋白等电点 为
4 . 5
，
绝大多数，
α
及
β
球蛋白等电点均小于
6 ）
。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的
β
－球蛋白、
α
－ 球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。

3.
血清白蛋白纯度及相对分子量的测定

SDS
－
PAGE
是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质 纯度检测和
测定蛋白质分子量。

电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有 关，如电荷、形
状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。

SDS
的作用< br>：
1.
能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原
剂（ 巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；
2.
能与变性的蛋白质按比例结合，
形成
SDS-
蛋白质复合物。

SDS-
蛋白质复合物的特点：
1.
由于结合大量的
SDS
，
使蛋白质丧失了原有的电荷状态，
从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异；
2.
复合物都是椭圆棒状，从而降
低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。< br>
因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。

在一定范围 内，
蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，
符合下式：
logMW=K-Bx< br>（
MW
为分子量，
X
为迁移率，
k
、
b均为常数）

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲 线，未
知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

该法测定蛋白质分子量的局限性：

1.
蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两 条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，
测定时只是它们的亚基或单条肽链的
MW
。< br>
2.
电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）
。

3.
结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）
。

4.
带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）
。

4.
血清白蛋白含量的测定

考马斯亮蓝
G250
的磷酸溶 液呈棕红色，最大吸收峰在
465nm
。当它与蛋白质结合形
成复合物时呈蓝色，其最 大吸收峰改变为
595nm
，考马斯亮蓝
G250 -
蛋白质复合物的高消< br>光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝
G250-
蛋白质 复合
物呈色后，
在
595nm
下，
吸光度与蛋白质含量呈线性关系，
故可以用于蛋白质浓度的测定。



三
.
实验步骤

1
．
血清白蛋白的初步分离

（
1
）收集血清：取
5 ml
血液，
4
℃，
3,000 rpm
离心
15 min
，用移液枪吸取上清（血清）
1 ml
至
10 ml
离心管，留
0.1 ml
（样
1
）至
1.5 mL
离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；

（
2
）量筒量取
9
ml
底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断的摇晃或振荡，
4
℃
静置
2 h
；
（底液为
50 %
的饱和硫酸铵溶液）
；

（
3
）
4
℃，
3,000 rpm
离心
15 min
，收集上清，留
0.5 ml
至
1.5 ml
（样
2
）离心管，用于
测定蛋白质含量和电泳；

（
4
）用
5%
的柠檬酸缓冲液调节
pH
至
4.5
（
7-9
滴，白蛋白的等电点）
，用量筒确定上清液
的体积，计算加入饱和硫酸 铵（
pH
＝
4.5
）的体积（
0.11
×
V
）
；

（
5
）逐滴加入饱和硫酸铵（
pH
＝4.5
）
，边加边振荡，
4
℃静置
2 h
；

（
6
）
4
℃，
3,000 rpm
离心
20 min
，弃上清，沉淀用
0.5 ml pH 7.4
的柠檬酸
-Na2HPO4
缓
冲液溶解，留
0.1 ml
至
1.5 ml
离心管（样
3
）

，用于测定蛋白质含量和电泳；

（
7
）将剩余的
0.4 ml
蛋白质溶液将透析袋中，放入
pH 7.4
的柠檬酸
-Na2HPO4< br>缓冲液中，
搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无
NH4
＋存在；
（透析袋的 制备：透析袋中部有不能碰，将
两条用棉线扎紧）
；

（
8
）
NH4
＋的检测（奈氏试剂检测）
：取
1 ml
透析液，加入
5
滴奈氏试剂，混匀，观察，
如果出现砖红色沉淀，说明仍 有
NH4
＋存在，需继续透析；

2
．
血清白蛋白的纯化

（
1
）装柱：将层析柱固 定，保持垂直位。将浸胀的
DEAE-
纤维素装入柱内，至
8-10cm
高< br>度，
平衡过夜
（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）
；
（
2
）
准备
60
－
100
支试管， 置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节流速
为

1mL/min
，蛋白质检测器调零；

（
3
）
上 样：
将透析袋剪开，
用移液管转至凝胶面上，
待样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，< br>使样品完全进入胶内；

（
4
）洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵 ，用
0.02
～
1.0mol
／
L
醋酸－醋酸铵缓冲液（
pH7.4
）进行梯度洗脱，收集；记录出现峰值的管号；保存样品。

3
．
血清白蛋白纯度及相对分子量的测定

（
1
）胶的制备（
SDS-PAGE)

编号

1
2
3
4
5
6
7
总体积

溶液名称

30% Acr
–
0.8% Bis
pH 8.9 Tris -HCI
pH 6.7 Tris- HCI
10%SDS
TEMED
10%AP
H2O


胶的制备（
PAGE)
编号

1
2
3

5
6
7
总体积

溶液名称

30% Acr
–
0.8% Bis
pH 8.9 Tris -HCI
pH 6.7 Tris- HCI

TEMED
10%AP
H2O

12%
分离胶

2.0ml
1.25ml
-

2.5ul
50ul
1.75ml
约
5 mL
4%
浓缩胶

0.33ml
-
0.63ml

2.5ul
12.5ul
1.53ml
约
2.5 mL
12%
分离胶

2.0ml
1.25ml
-
100ul
2.5ul
50ul
1.65ml
约
5 mL
4%
浓缩胶

0.33ml
-
0.63ml
25ul
2.5ul
12.5ul
1.5ml
约
2.5 mL

（
2
）
样品的处理：

向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液，充分溶解后，
加盖
（不要密闭）< br>，置沸水浴
3 min
，取出冷至室温。

上样顺序：
（
1
）标准蛋白；

（
2
）收集的蛋白质溶液；

（
3
）柱层析出现高峰的管号蛋白质溶液；

加样量：
20
μ
l.
（
3
）

电泳：点样端负极，恒压：开始
80V
，待样品进入分离胶后改为
100V
进 行电泳。

（电极缓冲液：
pH 8.3 Tris
–
Gly
）

（
4
）染色：脱色考马斯亮兰
R-250
，
4h
或过夜。

（
5
）脱色：先用 蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇
=75
：
875
：50
）脱
色
2-6h
。

计算血白蛋白的相对分子量

：
logMW=k-bx
（
MW
为分子量，
x
为相对迁移率，
k
、
b
均为常数 ）

4
．
血清白蛋白含量的测定