吴乃虎—基因工程原理

2021年2月28日发(作者：脑白金成分)
目录

第一章


基因与基因工程

第一节

基因研究的发展

第二节

基因的现代概念

第三节

基因工程的诞生及其主要的研究内容

第二章


基因操作的主要技术原理

第一节

核酸的凝胶电泳

第二节

核酸分子杂交

第三节

细菌转化

1.

肺炎球菌的转化

2.

大肠杆菌的转化

3.

细菌转化频率

第四节

DNA
核苷酸序列分析

第五节

基因的化学合成

第六节

基因定点突变

第七节

基因扩增

第八节

研究
DNA
与蛋白质相互作用的方法

第三章


基因克隆的酶学基础

第一节


核酸内切限制酶与
DNA
分子的体外切割

1.

寄主控制的限制与修饰现象

2.

核酸内切限制酶的类型

3.

I
型和
III
型核酸内切限制酶的基本特性

4.

II
型核酸内切限制酶的基本特性

[1].

基本特性

[2].

同裂酶

[3].

同尾酶

[4].

限制片段末端的连接作用

5.

核酸内切限制酶的命名法

6.

影响核酸内切限制酶活性的因素

[1].

DNA
的纯度

[2].

DNA
的甲基化程度

[3].

酶切消化反应的温度

[4].

DNA
分子的结构

[5].

核酸内切限制酶的缓冲液

7.

核酸内切限制酶对
DNA
的消化作用

[1].

核酸内切限制酶与靶
DNA
识别序列的结合模式
[2].

核酸内切限制酶对
DNA
分子的局部消化作用

[3].

核酸内切限制酶对真核基因组
DNA
的消化作用
第二节

DNA
连接酶与
DNA
分子的体外连接

1.

DNA
连接酶

2.

粘性末端
DNA
片段的连接

3.

平末端
DNA
片段的连接

[1].

同聚物加尾法


1


[2].

衔接物连接法

[3].

DNA
接头连接法

4.

热稳定的
DNA
连接酶

[1].

寡核苷酸连接测定法

[2].

连接酶链式反应
(LCR)
第三节







DNA
聚合酶

1.

DNA
聚合酶
I
与核酸杂交探针的制备

[1].

DNA
聚合酶
I

[2].

DNA
缺口转移

[3].

DNA
杂交探针的制备

2.

大肠杆菌
DNA
聚合酶
I
的
Klenow
片段与
DNA
末端标记
3.

T4 DNA
聚合酶和取代合成法标记
DNA
片段

4.

依赖于
RNA
的
DNA
聚合酶与互补
DNA
的合成

5.

T7 DNA
聚合酶

6.

修饰的
T7 DNA
聚合酶

第四节

DNA
及
RNA
的修饰酶

1.

末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾

2.

T4
多核苷酸激酶与
DNA
分子
5
’
-
末端的标 记

3.

碱性磷酸酶与
DNA
脱磷酸作用

第五节


核酸外切酶

1.

核酸外切酶

VII (exo VII)
2.

核酸外切酶

III (exo III)
3.

?
核酸外切酶

(
??
exo)
和
T7
基因
6
核酸外切酶

第六节

单链核酸内切酶

1.

S1
核酸酶与
RNA
分子定位

2.

Bal1
核酸酶与限制位点的确定

第四章


基因克隆的质粒载体

第一节

质粒的一般生物学特性

1.

质粒
DNA
2.

质粒
DNA
编码的表型

3.

质粒
DNA
的转移

[1].

质粒的类型

[2].

F
质粒

[3].

质粒
DNA
的接合作用

4.

质粒
DNA
的迁移作用

5.

质粒
DNA
的复制类型

6.

质粒
DNA
的不亲和性

[1].

质粒的不亲和性现象

[2].

质粒不亲和性的分子基础

7.


第二节

质粒
DNA
的复制与拷贝数的控制

1.

质粒
DNA
复制的多样性

2.

ColE 1
质粒
DNA
复制的启动

3.

质粒
DNA
拷贝数的控制


2

[1].

天然质粒拷贝数的控制

[2].

杂种质粒拷贝数的控制

4.

质粒复制控制的分子模型

[1].

抑制蛋白质稀释模型

[2].

自体阻遏蛋白质模型

5.


第三节

质粒
DNA
的分离与纯化

1.

2.

3.

4.

氯化铯密度梯度离心

碱变性法

微量碱变性法

影响质粒
DNA
产量的因素

[1].

寄主菌株的遗传背景

[2].

质粒的拷贝数与分子大小

5.


第四节

质粒载体的构建与类型

1.

天然质粒用作克隆载体的局限性

2.

质粒载体必须具备的基本条件

3.

质粒载体的选择记号

[1].

高拷贝数的质粒载体

[2].

低拷贝数的质粒载体

[3].

失控的质粒载体

[4].

插入失活型的质粒载体

[5].

正选择的质粒载体

[6].

表达型的质粒载体

4.


第五节

重要的大肠杆菌质粒载体

1.

pSC101
质粒载体

[1].

应用
pSC101
质粒作基因克隆载体的实例一
---
葡萄球菌质 粒基因在大肠
杆菌中的表达

[2].

应用
pSC101
质粒作基因克隆载体的实例二
---
在大肠杆菌中克隆非洲爪
蟾

2.

Col 1
质粒载体

3.

pBR322
质粒载体

[1].

pBR322
质粒载体的构建

[2].

pBR322
质粒载体的优点

[3].

pBR322
质粒载体的改良

[4].

应用
p BR322
质粒作为基因克隆载体的实例
---
水稻夜绿体光诱导基因
psb A
的结构分析

4.

pUC
质粒载体

[1].

pUC
质粒载体的结构

[2].

pUC
质粒载体的优点

5.

其他重要的质粒载体

[1].

丧失迁移功能的的质粒载体

[2].

能在体外转录克隆基因的质粒载体


3
[3].

穿梭质粒载体

第六节

质粒载体的稳定性问题

1.

质粒载体不稳定性的类型

[1].

结构的不稳定性

[2].

分离的不稳定性

2.

影响质粒载体稳定性的主要因素

[1].

新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应

[2].

拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响

[3].

寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应

3.

随机分配的分子机理

[1].

通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平

[2].

通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体

[3].

通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生

[4].

大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性

4.

主动分配的分子机理

[1].

分配区的结构与功能

[2].

预配对模型

[3].

二聚体的解离有助于质粒的主动分配

[4].

寄主致死功能对质粒稳定性的效应

5.


第五章


噬菌体载体和柯斯载体

第一节

噬菌体的一般生物学特性

第二节

?
噬菌体载体

第三节

柯斯质粒载体

第四节

单链
DNA
噬菌体载体

第五节

噬菌体载体

第六章


基因的分离与鉴定

第一节

DNA
克隆片段的产生与分离

1.

基因组
DNA
克隆片段的产生与分离

2.

DNA
片段的大小分部

3.

编码目的基因的克隆片段的富集

第二节

重组体
DNA
分子的构建及导入受体细胞

1.

外源
DNA
片段同载体分子的重组

[1].

外源
DNA
片段定向插入载体分子

[2].

非互补粘性末端
DNA
分子间的连接

[3].


最佳连接反应

2.

重组体分子导入受体细胞的途径

[1].

重组体
DNA
分子的转化或转染

[2].

体外包装的
?
噬菌体的转导

第三节

基因克隆的实验方案

1.

互补作用基因克隆

2.

cDNA
基因克隆

[1].

cDNA
文库的建立

[2].

不同丰度
mRNA
的
cDNA
克隆


4
[3].

全长
cDNA
的合成

[4].

cDNA
克隆的优越性

3.

基因组
DNA
克隆

[1].

应用
?
噬菌体载体构建基因组文库

[2].

应用柯斯质粒载体构建基因组文库

4.

基因定位克隆

[1].

拟南芥菜简介

[2].

RFLP
分子标记

[3].

RFLP
作图的原理与步骤

[4].

染色体步移

[5].

大尺度基因组物理图谱的构建

第四节

克隆基因的分离

1.

应用核酸探针分离克隆的目的基因

[1].

核酸探针的来源

[2].

寡核酸探针的的人工合成

[3].

假阳性克隆的克服

2.

应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因

[1].

差别杂交

[2].

差别杂交的局限性

[3].

扣除杂交

3.

应用
mRNA
差别显示技术分离克隆的目的基因

[1].

mRNA
差别显示的原理

[2].

mRNA
差别显示的基本过程

[3].

mRNA
差别显示的局限性

4.

引用表达文库分离克隆的目的基因

5.

酵母双杂交体系

[1].

酵母双杂交体系的基本原理

[2].

酵母双杂交体系的寄主菌株

[3].

酵母双杂交体系的实验程序

第五节

重组体分子的选择与鉴定

1.

遗传检测法

[1].

根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法

[2].

根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法
2.

物理检测法

[1].

凝胶电泳检测法

[2].

R-
检测环法

3.

菌落或噬菌斑杂交筛选法

4.

免疫化学检测法

[1].

放射性抗体检测法

[2].

免疫沉淀检测法

[3].

表达载体产物之免疫化学检测法

5.

DNA
蛋白筛选法

6.

转译筛选法

[1].

杂交抑制的转译

5


[2].

杂交选择的转译

第七章


基因的表达与调节

第八章


真核基因在大肠杆菌中的表达

第一节

真核基因的大肠杆菌表达体系

第二节

大肠杆菌的表达载体

第三节

克隆的真核基因在大肠杆菌中的表达

第四节

影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素

第九章


植物基因工程

第十章


哺乳动物基因工程

第一节

第二节

第三节

第四节

第五节

第十一章

第十二章





第一章

基因与基因工程

第一节

基因研究的发展

第二节

基因的现代概念

第三节

基因工程的诞生及其主要的研究内容

1.
基因工程
：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物
质的新组合，并 使之参与到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能够持续稳
定的繁殖。

2.

基因工程主要的研究内容：

3.

有关基因工程安全性的争论

4.

重组
DNA
技术的应用与发展

第二章


基因操作的主要技术原理

第二节

核酸的凝胶电泳

第三节

核酸分子杂交

第四节

细菌转化

细菌转化
：是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA
，而导致性

状特征发生遗传性改变的生命过程。
这种提供转化< br>DNA
的菌株称给体菌株，
而接受转
化
DNA
的寄主菌株称为 受体菌株。

1.

肺炎链球菌的转化



自然界也会发生细菌转化，但过程较复杂。



感受态（
competence
）
：



能够发生转化作用的细菌：肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、
流感嗜血杆菌等。

2.

大肠杆菌的转化

1)

在加入转化< br>DNA
之前，预先用
CaCl
2
处理大肠杆菌细胞，可使大肠杆菌
6
哺乳动物基因转移的遗传选择标记

外源
DNA
导入哺乳动物细胞的方法

SV 40
病毒载体

反转录病毒载体

其他的病毒载体

重组
DNA
与现代生物技术

重组
DNA
与医学研究

细胞呈现感受态。
在转化过程中< br>Mg
对于维持
DNA
的稳定性方面可能起
到重要作用。

2)

噬菌体
----
重组体
DNA
分子的体外包装法。

3.

细菌转化频率



细菌转化频率受多种因素限制：

1)

转化
DNA
的浓度、纯度、构型：

a)

环形
>
线形；

b)

大分子量的转化频率低于小分子量的。

2)

转化细胞的生理状态及其在
CaCl
2
处理和贮藏之后的成活率：

3)

许多细菌有限制修饰体系，
严重地影响了转化频率，
为了克服 这方面的困
难，
用做转化受体的大肠杆菌菌株，
一般都是选用在寄主控制的限制和修< br>饰体系上有缺陷的突变体，即
hsdR
和
hsdM
突变体。

4)

转化的环境条件如：温度、离子浓度、
pH
值。











应用与大肠杆菌转化程序类似的方法，也可以成功转化各种真核细胞。

第五节

DNA
核苷酸序列分析

第六节

基因的化学合成

第七节

基因定点突变

第八节

基因扩增

第九节

研究
DNA
与蛋白质相互作用的方法

第三章


基因克隆的酶学基础

1.

核酸酶：
通过切割相邻的两个 核苷酸残基之间的磷酸二酯键，
从而导致核酸分子多核
苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做
核酸酶
。

[1].

第一种分类方法：

1.)

核糖核酸酶（
RNase
）
：专门水解断裂
RNA
分子的核酸酶；

2.)

脱氧核糖核酸酶
(DN ase)
：特异水解断裂
DNA
分子的核酸酶

[2].

第二种分类方法（按核酸酶断裂核酸分子的方式）
：

1.)
从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链的核酸
酶，称为
核酸 外切酶
(exonuclease)
；

2.)

从核酸分 子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段的核酸酶，叫做
核酸内切酶
(endonucleas se)
；

[3].

3
2.

重组< br>DNA
技术赖以创立的重要的酶学基础：
核酸内切限制酶
(restricti on endonucleases)
和
DNA
连接酶
(ligase)
第一节


核酸内切限制酶与
DNA
分子的体外切割

核酸内切限制酶
：是一类能够
识别
双链
DNA
分子中的某种特定核苷酸序列，并
由此
切割
DNA
双链的核酸内切酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来
的。

—
—
2+
1.

寄主控制的
限制 （
restriction
）与修饰
(modification)
现象(
简称
R/M
体系
)
以噬菌体感染细菌为例。
寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，该现象是由
2
种酶活性配合完
成的：一 种叫修饰的甲基转移酶，一种叫核酸内切限制酶。

位点特异的甲基化酶能催化甲基
(-CH
3
,
或以
Me< br>表示
)
从其给体分子
S-
腺苷
甲硫氨酸
(S-ade nosylmethionine, SAM)
，
转移给限制酶识别序列的特定碱基，
使之甲基化。


7
核酸内切限制酶是无法识别甲基化的序列的。

2.

核酸内切限制酶的类型

目前鉴定出
3
种不同类型的核酸内切限制酶：

I
型酶，< br>II
型酶，
III
型酶，
具有不同的特性。其中
II
型酶，由于其核酸内切限制酶活性和甲基化作用
活性是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故 在基因克隆中有
特别广泛的用途。

[1].

I
型酶的
2
个代表
EcoK
和
EcoB
是分别从大肠杆菌
K
株和
B
株中分离
到的，它们的分子量约为

300 000 dal
。

[2].

通常是把核酸内切限制酶产生的
DN A
片段进行凝胶电泳，来分析和研
究这些酶的活性。

[3].

IIs
型核酸内切限制酶是移动切割
(shifted
cleavage)
的限制酶，这种酶是
在离它的不对称识别序列一侧的一个精确距离处，造成
DNA双链的断
裂。

[4].

除了
I~III
型 酶外，
20
世纪
80
年代又发现了其他类型的限制酶：
在一些
通用的大肠杆菌寄主菌株中各种不同来源的细菌及真核
DNA
分子中存
在的甲基胞嘧 啶引起了在相应寄主菌株的限制作用，
称为修饰的胞嘧啶
限制作用
(modified cytosine restriction, Mcr)
。大肠杆菌中有
2
种
Mcr
体
系。

3.

I
型和
III
型核酸内切限制酶的基本特性

[1].
I
型和
III
型核酸内切限制酶一般都是大型的多亚基的蛋白复合物，
既 具
有内切酶活性，又具有甲基化酶活性

4.

II
型核酸内切限制酶的基本特性

II
型核酸内切限制酶只有一种 多肽，
并通常以同源二聚体形式存在，
它具有
三个特性：

1.)

在
DNA
分子双链的特异性识别序列部位，切割
D NA
分子产生链的
断裂；

2.)

2
个单链断裂 部位在
DNA
分子上的分布，
通常不是彼此直接相对的；

3.)

因此，
断裂的结果形成的
DNA
片段，
也 往往具有互补的单链延伸末
端；

[1].

基本特性

1.)

核酸内切限制酶的识别序列
：绝大多数
II
型核酸 内切限制酶都能够
识别由
4~8
个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，这样的序列称为核
酸内切限制酶的识别序列。
而限制酶就是从其
识别序列
内
切割
DNA
分子的，因此识别序列又称为
核酸内切限制酶的切割位点或靶子序
列
。识别序列可以是连续的或间断的，一个共同特点是它们具有双
重旋转对称的结构形式，即这些核
苷酸对的顺序呈回文结构
。

2.)

限制酶识别的靶子序列同< br>DNA
的来源无关，
也就是说不带有种的特
异性，是对各种
DNA普遍适用的。

3.)

由核酸内切限制酶的作用造成的
DNA
分子的断裂类型，
通常是属于
下述
2
种独特的排列方式之一：

A.

两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称
轴排 列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的
DNA
片段；

B.

两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的
断裂结果形成具有平末端的
DNA
片段。


8
4.)

粘性末端：是指
DNA
分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基
的单链延伸末端结构，它 们能够通过互补碱基间的配对而重新环化
起来。有两种粘性末端：

A.

具有
3
’
-OH
单链延伸的粘性末端：

B.

具有
5
’
-P
单链延伸的粘性末端：

5.)

具有平末端的
DNA
不易重新环化。

6.)

影响限制酶切割频率的因素：

A.

靶子序列长度；

B.

DNA
碱基成份：如
Not
I
限制酶的识别序列由
8个碱基组成，
其中包括
CpG
，这在哺乳动物中是及其罕见的，因此，该酶切割
DNA
产生的片段大小可达
(1~1.5
)
×
10< br>bp
，特别适用于哺乳
动物
DNA
大尺度物理图谱的构建。

7.)

6
[2].

同裂酶
(isoschizomers)
1.)

同裂酶：
有一些来源不同的限制酶
识别的是同样的核苷酸靶子序列
，
这类酶特称为同裂酶。同 裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。

2.)

有些同裂酶对于切割位点 上的甲基化碱基的敏感性有所差别，顾可
用来研究
DNA
甲基化作用。

3.)

现已发现许多动物，包括脊椎动物和棘皮动物基因组
DNA
中
90%
以上的甲基都是在序列
CG
处以
5
’
-< br>甲基胞嘧啶的形式出现。

[3].

同尾酶
(isocaudamer)
1.)

同尾酶：有一些来源 不同的限制酶识别的靶子序列也不相同，但产
生出
相同的粘性末端
，
特称为同 尾酶。
由同尾酶所产生的
DNA
片段，
是能够通过其粘性末端之间的互补作用 而彼此连接起来的。

2.)

常用的限制酶：
BamHI
、

BclI
、

BglII
、

Sau3AI
、

XhoII
就是一组
同尾酶。

3.)

由一对同 尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，
特称为
“杂
种位点”
（
hybrid site
）
。这类杂种位点的结构，一般是不能再被原来
的任何一种 同尾酶所识别的。不过亦有例外情况：由
Sau3AI
和

BamHI
同尾酶形成的杂种位点，
对
Sau3AI
则仍然是很敏感的，
但已
不再是
BamHI
的靶子位点。

[4].

限制片段末端的连接作用

由限制酶产生的具粘性末端的
DNA
片段 间的连接作用有两种不同的类
型：

1.)

分子间的连接：
不同的
DNA
片段通过互补的粘性末端之间的碱基配
对而彼此连接起来，这种连接称 为
~
；

2.)

分子内的连接：由同一片段的
2
个互补末端之间的碱基配对而形成
的环形分子，这种连接称为
~
。

[5].

5
6
5.

核酸内切限制酶的命名法

采用

和
s(1973)
提议的命名系统，其命名原则包括：

1.)

用属名的第一个字母和种名的前两个字母，组成
3
个字母的 略语表
示寄主菌的物种名称；

2.)

用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型。如果限制与修饰体系

9
在遗 传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的寄主菌的种名右下方
附加一个标注字母，表示此染色体外成份。

3.)

如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以
罗马数字表示。

4.)

所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶
R
外，还带有 系统的
名称。同样的，修饰酶则在他的系统名称之前加上甲基化酶
M
的名
称。

在实际应用中，这个命名体系已经做了进一步的简化：

1.)

由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略
语字母写成一行。

2.)

在上下文已经交待得很清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名
称
R
便省去。

6.

影响核酸内切限制酶活性的因素

[1].

DNA
的纯度

1.)

核酸内切限制酶消化
DN A
底物的反应效率，在和大程度上是取决于
所使用的
DNA
本身的纯度。
2.)

应用微量碱法制备的
DNA
制剂，常含有下列杂质： 蛋白质、酚、氯
仿、酒精、乙二胺四乙酸
(EDTA)
、十二烷基硫酸钠
(S DS)
、高浓度的
盐离子，都有可能抑制核酸内切酶的活性。

3.)

为了提高核酸内切限制酶对低纯度
DNA
制剂的反应效率， 一般采用
如下方法：

A.

增加核酸内切限制酶的用量，平均每微 克底物
DNA
可高达
10
单
位或甚至更多些；

B.

扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素别相应的稀释；

C.

延长酶催化反应的保温时间。

4.)

按 微量碱法制备的
DNA
制剂中，会含有少量的
DNase
的污染，再加
入了核酸内切限制酶缓冲液之后，
DNA
则会被
DNase
迅速的降解，< br>要
避免发生这种情况，唯一的办法是使用高纯度的
DNA
。

5.)

在反应混合物中加入适量的
聚阳离子亚精胺
(polycation spermid ine)
（
一
般终浓度为
1~2.5mmol/L
）
，有利 于核酸内切限制酶对基因组
DNA
的
消化作用。但鉴于在
4
℃下亚精 胺会促使
DNA
沉淀，所以务必在反应
混合物于适当的温度下保温数分钟之后方可加入 。

[2].

DNA
的甲基化程度

核酸内切限制酶不能切割甲基化的核苷酸序列。

1.)

通常从大 肠杆菌寄主细胞中分离而来的质粒
DNA
，
都混有两种作用于
特定核苷酸序列 的甲基化酶：一种是
dam
甲基化酶，催化
GA
TC
序列
中 的
A
残基甲基化；另一种是
dcm
甲基化酶，催化
CCA/TGG< br>序列内
部的
C
残基甲基化。因此，从正常的大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA
，只能被核酸内切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。为了避
免产生这样的问题， 在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大肠杆菌
菌株制备质粒
DNA
。

2.)

哺乳动物的
DNA
有时也会带有
5-
甲基 胞嘧啶残基，而且通常是在
G
残基的
5
’
一侧。因此不同位点之间的 甲基化程度是互不相同的，而且
还与
DNA
来源的细胞类型有密切关系。


10
3.)

真和基因组
DNA
的甲基化作用 模式，可以根据各种同裂酶所具有的
不同的甲基化敏感性进行研究。

4.)

核酸内切限制酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，这种特性在有些情
况下是很有用的：

A.

当甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序列相邻时，就会抑
制在这 些位点发生切割作用，这样便改变了核酸内切限制酶识别
序列的特异性。

B.

若要使用合成的衔接物修饰
DNA
片段末端，一个重要的处理 是
必须在衔接物被酶切前，通过甲基化作用将内部的限制酶识别位
点保护起来。

5.)

5
[3].

酶切消化反应的温度

1.)

不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有
相当大的变动范围。

2.)

大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是3
7
℃，但也有许多例外的情
况，它们要求在
3
7
℃以 外的其它反应温度。

3.)

消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影 响核酸内切限制酶的活
性，甚至最终导致完全失活。

[4].

DNA
分子的结构

DNA
分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大影响。

大体来说，
一
种核酸内切限制酶对其不同识别位点切割速率
的差别最多
不会超过
10
倍，尽管这样的范围在通常的标准下是无关紧要的，然而
涉及到局部酶切消化时，则是必须 考虑的因素
。

1.)

某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒
DNA

或病毒
DNA
所需要的
酶量，要比消化线性
DNA
的高出许多倍，最高的可达
20
倍；

2.)

有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限 制位点，
其效率亦有明显差别。
这很可能是由于侧翼核苷酸成分的差异造成的。

3.)

DNA
分子中有些特定的限制位点，
只有当其他的限制位点 也同时被广
泛切割的条件下，才能被有关的核酸内切限制酶所消化。

4.)

少数一些核酸内切限制酶，例如
NarI
、
NaeI
、
Sa cII
及
XmaIII
等，对
不同部位的限制位点的切割活性会有很大差异， 其中有些位点是很难
被切割的。

[5].

核酸内切限制酶的缓冲液

1.)

核酸内切限制酶的标准缓冲液的 组份包括：
MgCl
2
、
KCl
、
Tris-Cl
、
?
-
巯基乙醇、二硫苏糖醇
(DTT)
、
BSA
等。

A.

酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是
Mg
2+
。
不正确的阳离子浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导
致识别序列特异性的改变。

B.

缓冲液
Tris-Cl
的作用：使反应混合物的
pH
恒定在酶活性所要求
的最佳数值的范围之内。
对 绝大多数限制酶来说，
在
pH=7.4
的条
件下，其功能最佳。

C.

巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且
还可保 护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染物质的稳
定性。


11
D.

有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化十分敏
感，而另 一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化
幅度。

2.)
在“非最适的”反应条件下，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性
便会发生“松动”
，从 其“正确”识别序列以外的其他位点切割
DNA
分子

3.)
有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较
明显。如果缓冲液的成份发生变 化，那么其识别序列的特异性就会发
生松动
(
如
EcoRI)
，这种 特别的识别能力，通常叫做
星号活性
(star
activity)
,
（以
EcoRI*
表示）

[6].

6
7.

核酸内切限制酶对
DNA
的消化作用

[1].

核酸内切限制酶与靶
DNA
识别序列的结合模式

通过
X-
射线晶体学技术，
发现：
II
型核酸内切限制酶，
是以同型二聚体
形式与靶
DNA
序列发生作用的。

[2].

核酸内切限制酶对
DNA
分子的局部消化作用

1.)

如果一种核酸内切限制酶对
DNA
分子的切割反应达到了理 论上计
算
的
片
段
化
水
平
，
则称
之
为
完
全
的
酶
切
消
化作
用
(complete
digestion)
。实际上，核酸内切限 制酶对
DNA
分子的消化作用的频
率要低于完全消化的频率。

2.)

不
完
全
的
限
制
酶
消
化
反
应
，
通
常
叫
做
局
部
酶
切
消
化
（
partial
digesti on
）
。在进行局部消化的反应条件下，任何
DNA
分子中都只
有有 限数量的一部分限制位点被限制酶所切割。

3.)

在实验工作中，
通过
a.
缩短酶切消化反应的保温时间，
b
降低反映的
温度以约束 酶的活性，都可以达到局部消化的目的。
.
[3].

核酸内切限制酶对真核基因组
DNA
的消化作用

一旦一种靶
DNA
分子被某种核酸内切限制酶消化之后：

A.

如
果
分
子
量
较
小
，
可通
过
琼
脂
糖
凝
胶电
泳
或高
效
液相
层
析
(high-performance
liquid
chromatography,
HPLC)
将目的基因片段
分离出来，做进一步的克隆扩增或其他研究；

B.

如果分子量较大（
10
~10
bp
）
，则需要
建立相应的基因文库
的方
法才能达到分离的目的。

[4].

4
第二节

DNA
连接酶与
DNA
分子的体外连接

5
6
1.

DNA
连接酶（
DNA
ligase
）

[1].

DNA
连接酶：连接的
DNA
链必须是双螺旋
DNA
分子的一部分，
DNA
连接酶是封闭 双螺旋
DNA
上的
缺口
(nick)
（缺口即在双链
DNA
的某一
条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂）
；
而不能封闭裂口
(gap)
（裂口即在双链
DNA
的某一条链上失去一个或数
个核苷酸所形成的单链断裂。
）

[2].

DNA
连接酶发挥作用需要在一条
DNA
链的
3
’
-
末端具有一 个游离的羟
基，

和在另一条链
5
’
-
末端具有一 个磷酸基团，只有在这样的情况下，
DNA
连接酶才能发挥其连接
DNA
分子 的作用。
同时，
由于在羟基和磷
酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能的反应，因此还 需要能源分子：

12
在大肠杆菌及其他细菌中，
利用
NAD
(nicotinamide adenine dinucleotide
(oxidized form))
做能源的， 而在动物细胞及噬菌体中，则是利用
A
TP
做
能源的。

+
[3].

T4
噬菌体编码的
DNA
连接酶， 能够连接两条平末端的双螺旋的
DNA
片段。

[4].

DNA

连接酶连接
DNA
的分子机理：

[5].

DNA
连接酶的来源：

+
A.

由大肠杆菌染色体编码的叫做
DNA
连接酶
，
该酶用
NAD
做能源
辅助因子；一般来说，大肠杆菌
DNA连接酶不具备催化连接平
末端
DNA
片段的能力，
除非是在大分子
DNA
十分稠密饱和的特
殊反应条件下，才会发生例外的情况。

B.

由大肠杆菌
T4
噬菌体
DNA
编码的叫做
T4
DNA
连接酶
，该 酶
用
A
TP
做辅助因子；
连接缺口，
在存在
ATP
和加入高浓度酶的条
件下，还能够连接具有完全碱基配对的平末端的
DNA< br>分子，这
种反映的机理不甚明了。该酶容易制备，且能够连接两条平末端
的双螺旋的DNA
片段，因此在分子克隆中有广泛用途。

这两种酶作用机理相差不大。

[6].

DNA
连接酶连 接缺口
DNA
的最佳反应温度是
3
7
℃。但是，在此温度
下 ，
粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。
因此连接粘性末端的最佳温
度，应该是介于酶 作用速率和末端结合速率之间，一般认为是
4~15
℃
比较合适。

[7].

检测连接反应效率的方法
;
A.

凝胶电泳法：该法不十分可靠；

B.

1986 V
.
King
和

W. Blakeskey
提出，根据链接反应物转化 感受态细
胞的能力，作为判断连接效率的标准。

[8].

影响连接效率的因素：

A.

连接反应的温度；

B.

T4 DNA
连接酶的用量：

1.)
< br>在平末端
DNA
分子的连接反应中，
最适的反应酶量大约是
1~2单位；

2.)

在粘性末端
DNA
分子的连接反应中 ，最适的反应酶量是
0.1
单位；

C.

A
TP:
浓度变动范围保持在
10
?
mol~1mmol /L
之间时，对平末端、
粘性末端的连接效率都没有什么影响。
但无插入片段的平末端 载体
DNA
的环化作用受
A
TP
明显影响，浓度接近
0.1 mmol/L
时，环化
作用表达到最高值。

[9].

9
2.

粘性末端
DNA
片段的连接

[1].

重组
DNA
实验用粘性末端
DNA
片段 连接主要的缺点：由限制酶产生
的具有粘性末端的载体
DNA
分子，在连接反应混合物 中会发生自身环
化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。

[2].

克服上述缺点的方法：

A.

用细菌的或小牛肠的
碱性磷酸酶
(BAP
或
CIP)
，预 先处理线性的载
体
DNA
分子，以
移去其末端的
5
’
磷酸基团
。于是在连接反应中，

13