DNA提取个步骤作用原理

2021年2月28日发(作者：痛经吃什么药)
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用

细菌质粒是一类双链、闭环的
D NA
，大小范围从
1kb
至
200kb
以上不等。各种质粒都
是存在于细胞质中、独立于细胞染

色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持
续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，
随着染色体的复 制而复制，

并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克 隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒
DNA
分子。目前已有许多方法可用于质< br>
粒
DNA
的提取，本实验采用碱裂解法提取质
粒
DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒
DNA
的方法，
其 基本原理为：
当菌体在
NaOH
和

SDS
溶液中裂解时，
蛋白质与
DNA
发生变性，
当加入中和液后，
质粒
DNA< br>分子能
够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体
DNA
不 变性

而呈絮
状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒
DNA< br>的方法通常是利用了质粒
DNA
相对较小及共价闭环两个性质。例如，
氯化铯< br>-
溴化乙锭梯度平衡离心、离

子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀 等
方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒
DNA
，经过苯酚、氯仿抽 提，
RNA
酶消化和乙醇沉淀

等简单步骤去除残余蛋白质和
RNA
，
所得纯化的质粒
DNA
已
可满足细菌转化、
DNA
片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子
生物学实验室

中常用。


一、试剂准备

1.
溶液Ⅰ
:
50mM
葡萄糖，
25mM
Tris- HCl(pH
8.0)
，
10mM
EDTA(pH
8.0
）
。
1M
Tris-HCl[t1] (pH 8.0
）
12.5ml
，
0.5M EDTA
（
pH 8.0
）
10ml
，葡萄糖
4.730g
，加
ddH2 O
至
500ml
。在
10
lbf/in2
高压灭菌
15min
，贮存
于
4
℃。

任何生物化学反应，
首先要控制 好溶液的
pH
，
因此用适当浓度的和适当
pH
值的
Tris -Cl
溶液。
50
mM
葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子的底部。
因此，如果溶液
I
中缺了葡萄糖其实对质

粒的抽 提本身而言，几乎没有任何影响。所
以说溶液
I
中葡萄糖是可缺的。
EDTA
呢？大家知道
EDTA
是
Ca2+
和
Mg2+
等二 价金属
离子的螯合剂，配

在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制
DNas e
的活性，和抑制微
生物生长。在溶液
I
中加入高达

10 mM
的
EDTA
，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所
有二价金属离子都螯合 掉。如果不加
EDTA
，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，
只要是在不太长的时 间里完

成质粒抽提，就不用怕
DNA
会迅速被降解，因为最终溶
解 质粒的
TE
缓冲液中有
EDTA
。如果哪天你手上正好缺了溶液
I< br>，可不可以抽提质粒
呢？实话告诉你，

只要用等体积的水，或
LB
培养基来悬浮菌体就可以了。

这是用新鲜的
0.4 N
的
NaOH
和
2
％的SDS
等体积混合后使用的。
要新从浓
NaOH
稀释
制备
0.4N
的
NaOH
，无非是为了保证
NaOH
没有吸收空气中的
CO2
而减弱了碱

性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是
SDS
，
所以才叫碱法抽提。
事实上
NaOH
是 最佳

的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在
瞬 间就溶解，这是由于细胞膜发生了从
bilayer
（双层膜）结构向

micelle
（微囊）结构
的相变化所导致。用了不新鲜的
0.4 N N aOH
，即便是有
SDS
也无法有效溶解大肠杆菌
（不妨可以自己试一下）< br>，
自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用
SDS
当然也能抽提
得到少量质粒，因为

SDS
也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对
Na OH
的作用误以
为是为了让基因组
DNA
变性，
以便沉淀，
这是由于没有正确理解一些书上的有关
DNA
变性复

性的描述所导致。有人不禁要问，
既然是
NaOH
溶解的细胞，
那为什么要加
SD S
呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千

万 不
要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组
DNA
片断会慢慢断裂；第二， 必
须温柔混合（象对待女孩子一样）
，不然基因组
DNA
也会断裂。基因组< br>
DNA
的断裂
会带来麻烦。

3.
溶液Ⅲ：
醋酸钾
（
KAc
）
缓冲液，
pH 4.8
。
5M KAc 300ml
，
冰醋酸

57.5m l
，
加
ddH2O
至
500ml
。
4
℃保 存备用。

溶液
III
加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀 的本质。最容易产生的
误解是，当
SDS
碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往
1%
的

SDS
溶液中加如
2M
的醋酸溶液看看就 知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，
显然与
SDS
的加入有关
系 。如果在溶液
II
中不加
SDS
会怎样呢，也会有少量

的 沉淀，但量上要少得多，显然
是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然
SDS
不是遇酸 发生的沉淀，那会不会是遇盐
发生的沉淀呢？在
1
％的
SDS
溶液中 慢慢加

入
5
N
的
NaCl
，你会发现
SDS
在高盐浓
度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了
SDS
的沉淀。 但如果你加入的不是
NaCl
而
是
KCl
，
你
会< br>发
现
沉
淀
的
量

要
多
的< br>多
。
这
其
实
是
十
二
烷
基< br>硫
酸
钠
（
sodium
dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（
potassium dodecylsulfate, PDS
）
，
而
PDS
是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液
III
加入后的沉淀实际上是钾离
子置换了
SDS
中的钠离子形成了 不溶性的
PDS
，
而高浓度

的盐，
使得沉淀更完全。大
家知道
SDS
专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个
SD S
分子，钾钠离子
置
换
所
产
生
的
大
量
沉
淀
自
然
就
将
绝
大
部
分
蛋
白
质

沉
淀
了
，
让
[t3]
人高兴的 是大肠杆菌的基因组
DNA
也一
起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组
DNA
太长了，长长的
DNA
自然容易
被
PDS
给共沉淀 了，尽

管
SDS
并不与
DNA
分子结合。

1.
为什么用无水乙醇沉淀
DNA
？


用无水乙 醇沉淀
DNA
，这是实验中最常用的沉淀
DNA
的方法。乙醇的优点是可以任
意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对
DNA
很安全，因此是理想的沉
淀剂。


DNA
溶液是
DNA
以水合状态稳定存 在，当加入乙醇时，乙醇会夺去
DNA
周围的水分
子，使
DNA
失水 而易于聚合。一般实验中，是加
2
倍体积的无水乙醇与
DNA
相混合，
其乙醇的最终含量占
67
％左右。因而也可改用
95
％乙醇来替代无水乙醇 （因为无水乙
醇的价格远远比
95
％乙醇昂贵）
。但是加
95
％的乙醇使总体积增大，而
DNA
在溶液中
有一定程度的溶解，
因而
DNA
损失也增大，
尤其用多次乙醇沉淀时，
就会影响收得率。
折中的做法 是初次沉淀
DNA
时可用
95
％乙醇代替无水乙酵，
最后的沉淀步骤 要使用无
水乙醇。也可以用
0.6
倍体积的异丙醇选择性沉淀
DNA
。一般在室温下放置
15
－
30
分
钟即可。

< br>2.
在用乙醇沉淀
DNA
时，
为什么一定要加
NaAc
或
NaCl
至最终浓度达
0.1
～
0.25mol/L
？


在
pH
为
8
左右的溶液中，
DNA< br>分子是带负电荷的，加一定浓度的
NaAc
或
NaCl
，使
N a+
中和
DNA
分子上的负电荷，减少
DNA
分子之间的同性电荷相 斥力，易于互相聚
合而形成
DNA
钠盐沉淀，
当加入的盐溶液浓度太低时，< br>只有部分
DNA
形成
DNA
钠盐
而聚合，这样就造成
DNA
沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。
在沉淀的
DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响
DNA
的酶切等反应，必须要进行洗
涤或重沉淀