挖掘新基因资源的方法

2021年2月28日发(作者：男性外用延时)
挖掘新基因资源的方法概述






随着生物科技和基因工程技术的发展，酶制剂的开发和研究越来越需要更
多的酶基因资源，目前国内研究 方法主要有以下几种：

一


通过寻找新的微生物资源







我们寻找新的基因资源最直接和最传 统的方法就是通过对自然界的微生物
进行筛选，
获得更多的优良的微生物资源，
然后通 过分子生物学手段获取基因资
源，早期的研究大多数局限于此。微生物筛选的基本流程大致如下：

1.

根据不同的目的选取特定的地点采集样品，常选取比较极端的环境。

2.

对采集的样品进行处理，稀释培养，或者富集培养

3.

很据不同的样品和目的进行初筛，复筛。

菌种筛选的手段

筛选的 手段必需配合不同筛选阶段的要求，
对于
初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确， 测得的数据要能够
反映将来的生产水平。

1)

从菌体形态变异分析

有时，
有些菌体的形态变异与产量的变异存
在 着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管
相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但 是在筛选工作中应尽
可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方
法只能用于 初筛。

2)

平皿快速检测法

平皿快速检测法是利用菌 体在特定固体培养基
平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见
的

形态

变化。
具体的有纸片培养显色法、
变色圈法、
透明圈法 、
生长圈法和抑制圈法等。这些方法较粗放，一般只能定性或半定
量用，常只用于初筛，但它们 可以大大提高筛选的效率。它的缺
点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液
体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。
平皿快速检测法操作时应将培养的菌体 充分分散，形成单菌落，
以避免多菌落混杂一起，引起

形态

大小测定 的偏差。

4.

细菌的生理生化试验，各种代谢产物的测定。

5.

细菌培养鉴定，性能测定，克隆基因，表达分析。

缺点：开发周期太长；

优点：操作方法简单，获得较多的菌种资源。
大型设备：电子天平、超净工作台、高低温恒振荡培养箱、恒温水浴锅、可见光分
光光度计、高压蒸 汽灭菌锅、
PCR
仪，紫外成像系统。

实例：
筛选高温淀粉酶产生菌及克隆基因
（广西大学

薛蓓
2009
年硕士毕业论文）

i.

采样


在在高温环境（广西象州温泉）采样，共选择三个采样点，
即热泉口（温度
80
℃，
pH7.0
）
、温泉水（温度
73
℃，
pH6.5
）及温
泉旁边的底泥（温度
65
℃，
pH6.8
）
。

ii.

产
α
-
淀粉酶产生菌的菌株筛选


将采集的样品 分级稀释，涂布在以
可溶性淀粉为唯一碳源的
M9
培养基上，
于
60
℃
-80
℃倒置培养
24h
，
待长出菌落后，将平板置于< br>4
℃，直到淀粉板上透明圈明显后取出，
观察透明圈大小，并测量菌落直径（
C
）及透明圈直径
(H)
，计算透
明圈与菌落直径比值
(H/C)作为初筛指标，初步筛选出产淀粉酶高的
优良菌株进行进一步的纯培养。再以这些菌株为材料，液体 培养检
测其淀粉酶的活力以复筛选出了淀粉酶产量高的菌株。

iii.

菌株鉴定，

酶学性质测定


选取复筛优良菌株
65
℃，
200rpm
振荡
培养
24h
，测定发酵液酶活， 并初测其性质，并鉴定该菌株。

iv.

克隆高温淀粉酶基因


根据
GeneBank
已公布的与所筛选菌株同源
性最高的菌株里 淀粉酶的序列设计引物进行
PRC
扩增得到目的基
因。
该基因编码的淀粉酶在
80
℃下保温
20min,
残留活性在
85%
以上。

二


宏基因组技术挖掘新基因资源


< br>分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某
些环境中采用现有培养技 术能够培养的微生物不到
1%
，超过
99%
的微生物尚未
能培养(Amann RI, Ludwig W,1995)
，
可见基于微生物分离培养的技术 途径开发利
用微生物资源受到了极大的限制。
为了突破上述限制，
充分挖掘和利用微生 物的
多样性基因资源，
人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。
“
宏基因 组
”
即指
生境中全部微小生物遗传物质的总和，
目前主要指环境样品中的细菌 和真菌的基
因组总和
（
Handelsman J., Rondon M.R. Brady, 1998
）

。
宏基因组文库既包含了
可培养的又 包含了未能培养的微生物基因，
避开了微生物分离培养的问题，
极大
地扩展了微生物资 源的利用空间。
目前已采用土壤、
海水、
海洋浮游生物、
海棉、
甲虫 、
人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，
已筛选到的生物活性物质有
各种酶类及 一些次生代谢产物，包括脂酶
/
酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几
丁质酶、核酸酶、 膜蛋白、
4-
羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌
抗肿瘤活性物质及抗生 素抗性基因等。



宏基因组文库技术的主要流程如下：

1

从环境中提取宏基因组
DNA
；

先采集环境样品，处理，裂解，抽提总

DNA
，一般按处理样品方
式的不同划分为直接提取法和间接提取法。顾名思义，直接提取法就是
直接对样品进行裂解，释放其中 的

DNA
；间接提取法则是先分离样品
中的微生物，
后对微生物进 行裂解用核酸内切酶切割成一定长度的
DNA
片段并连接到合适的载体上。

2

转化宿主菌，形成一个重组的
DNA
文库即宏基因组文库。

将提取 的高质量的总
DNA
用合适的酶切、回收，然后和处理好的
合适的载体进行连接，转化 宿主。

3

宏基因组文库筛选。

由于环境样品中微生物 种类繁多，宏基因组文库容量一般较大，活
性克隆子的筛选是新活性物质筛选的瓶颈，根据研究目的,
可从生物活
性水平、化合物结构水平以及
DNA
序列水平设计不同的 筛选方案。


1
）生物活性水平的筛选

又称为功能驱动筛选

(function-driven
screening),
根据重组克隆产生的新活性进行筛选。采用各种活性检测手
段检测挑选活性物活性克隆子，进行生化分析和插入
DNA
片段序列分
析，进而对其深 入研究。这一策略以生为线索能够发现全新的活性物质
或基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工 作量大，效率低，并
且受检测手段的局限。


2
）
DNA
序列水平的筛选


又称为序列驱动筛选

(sequence-driven
screening),

以序列相似性为基础，执行某类功能的酶可能具有相识的
基因序列。
根据某些已知的相关功能基因的保守序列或相似序列设计杂
交探针或
PCR
引物，通过杂交或
PCR
扩增挑选阳性克隆。这一策略有
可能筛选到 某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，而且基于
DNA
的
操作有可能利用基因芯片技 术大大提高筛选效率，
但必须对相关基因序
列有一定的了解，较难发现全新的活性物质。


仪器设备

：恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，高速冷冻 离心机，
无菌工作台，低温冰箱
,
恒温水浴锅
,
制冰机
,
分光光度计，微量移液枪，
PCR
仪，精密移液器等。

该方法的难点是提取到高质量的
DNA
及高通量的筛选方法的建立。

优点：筛选范围广，获得全新基因资源几率大

缺点：对实验操作人员要求高，技术复杂，实验经费较昂贵

目前也有很多研究者直接 省略构建文库的步骤，以宏基因组
DNA
为模板，
设计兼并引物或其他引物探针进行扩 增基因。
如华南农业大学生物质研究所
（林
俊芳，
2009
年
7
月）就从海南，广州，新疆等地的环境样品中克隆到
12
个漆酶
基因片段 。

三

从蛋白质纯化着手的方法（纯化后克隆）

常规的基因克隆都是先通过构建基因文库或者
PCR
技术克隆到基因，
然后
通过对基因进行分析，
来展开对该基因所编码的蛋白质研究。
随着蛋白质化学和
蛋白 质技术的发展，
越来越多的研究者从天然的蛋白质出发，
然后对蛋白质部分
或者全部测 序，从而分子生物学手段获取基因。

若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白可根据目的蛋白的生物学功能
,
利
用 同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。
当所分离的目的蛋白较难大量
获得
,
但纯度较高时
,
可利用其中的一段氨基酸序列
,
反推出其基因序列
,
据此
合成寡核苷酸用于
cDNA
文库的筛选
;
或根据所获得的基因序列
,
指导
5′
端的
引物合成
,
根据
mRNA 3′
端
po ly2 A
序列指导合成
po ly2 T
的

3′
端引物
,
用

PCR
技术从制备细胞的
mRNA
或直接从胞浆内溶物物中合成相应的
cDNA ,
将
该

cDNA
克隆到表达载体上进行产物表达。

方法流程：

1
培养微生物，收集培养物。

2
分离纯化目标蛋白质，检测蛋白性质和纯度。

蛋白纯化主要有超滤，盐析（硫酸铵沉淀等）
，有机溶剂沉淀，离子