基因工程复习笔记

2021年2月28日发(作者：口服玻尿酸)
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第一
章

一、电泳


电泳
(eletrophorosis)
:
带电荷的分子在电场中以一定的 速率向与其电
荷性质相反的电极移动
.
移动速度称为电泳迁移率。


影响因素：
1
电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目
成正比。


2.
电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。



3
当电场强度一定
,
电泳介质相同
,
电荷相同的分子在电场中迁移的 速
度主要取决于分子本身的大小和形状
(
构型
)
。


4
分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关
:
分子量越大，
移动越慢。

指示剂：

溴酚蓝（

Bb
）

：常用指示剂。分子量
670
，分子筛效应
小，近

似于自由电泳，呈蓝紫色。



二甲苯青
(Xc)
：分子量
554.6
，
呈蓝色，迁移速度比
Bb
慢。

染料：溴化乙锭（
EB
）

1
、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点： 比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收
DNA
样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后 可长期保
存；能装载的
DNA
量大，达每孔
10
μ
gDNA
。

2
、
SDS-PAGE

原理：
SDS
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白
质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上 相同密度负电荷。
SDS
与蛋白质结合使蛋白质构象改变，
成为形状近似雪茄状的长椭 圆
棒，
SDS-
蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
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蛋白质
-SDS
复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影
响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。
二、
PCR
技术

定义：聚合酶链式反应（
Polymerase Chain Reaction
，< br>PCR
）技术，以
DNA
为模板，在引物、
dNTPs
、Taq
酶的作用下，经变性－退货－延
伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。
PCR
法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过
PCR
扩增而获得定点突变的基因或
DNA
片段。


影响因素：
（
1
）
Taq
DNA
聚合酶

（具有
5’
?
3’
聚合酶活性和
5’
?
3 ’
外切酶活性，但没有
3’
?
5’
外切酶活性因此不能修复错误的碱 基配
对）
。

（
2
）引物（
primer
）一般引物设计为长
15
—
30bp
；位置与待扩增的
模板
DNA
区段的两
3’
端序列互补（

5‘
端相同）的短DNA
；引物的
碱基组成：尽可能提高
G+C
含量，避免连续相同碱基排 列或内部回
文序列，避免形成引物二聚体。

（
3
）引物的
Tm
值：实际复性温度选择低于
Tm
值
5 oC
。

（
4
）
dNTPs
含量适中



（
5
）
Mg 2+
的浓度





（
6)
对照实验

三、
PCR
技术的扩展：反向
PCR
：不对称
PCR
：差异显示
PCR
。

反向
PCR


原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序
列

“
转变
”
成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品
DNA
，
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然后用连接酶连接成一个环状
DNA
分子，
通过 反向
PCR
扩增引物的
上游片段和下游片段。

不对称
PC R
：用于扩增单链
DNA
，单链
DNA
更适于测序。
mRNA
差别显示技术：
对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离
的有效方法 之一。将
mRNA
逆转录和
PCR
技术相互结合发展起来的
一种获得 差异表达基因的
RNA
指纹图谱技术，
也称为
DDRT- PCR
（差
别显示
RT-PCR
）
。

四、分子杂交

分子杂交
(
简称杂交
,molecular
hybridization)

其基本原理就是应用核
酸分子的变性和复性 的性质
,
使来源不同的
DNA(
或
RNA)
片段
,
按碱
基互补关系形成杂交双链分子
(heteroduplex)
。

五、
Blotting
（印迹）
：
凝胶电泳分离的
DNA< br>或
RNA
在杂交之前通过
毛细管虹吸作用或电导作用被转移到滤膜上，
而且是按照其在凝胶中
的位置原地
“
复印
”
上去，这一过程叫印迹。

六、常用的分子杂交类型


（
south
与
north
的区别）



1
、
Southern
blotting
：用
DNA（
RNA
）探针检测
DNA
。


基本过
程：
样品
DNA
样品

→

酶切

→

电泳

→

碱变性

→

转膜

→

固定
（
80
度或紫外线照射）→杂交

→

洗涤

→放射自显影

2
、
Northern < br>blotting
：用
DNA
（
RNA
）探针检测
m RNA
样品。提
取完整
mRNA
；进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，破坏
RNA
的局部双
螺旋；其它步骤的原理与
Southern
印迹相似。与< br>Southern blotting
相
比，
Northern blotti ng
条件较严格，特别是
RNA
易降解，前期制备和
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转膜要防止
Rnase
的污染。不需酶切。

3
、
原位杂交
(Situ hybridization)
：
细
胞
及
染
色
体
上
检
测
特
异
D
N
A
或
R
N
A
序
列
的
一
种
技
术
，
是
一
种
直
接
，
简
便
的
研
究
基
因
定
位
和
表
达
的
方
法
。

组织原位杂交（
tissue in situ hybridization
）和菌斑原位杂交

4
、蛋白质免疫印迹
(Western-blotting)
七、
DNA
序列分析

1
、
Sanger
双脱氧终止法

*

原理：双脱氧核苷酸，
2
’
、
3
’都脱氧，
3
’无
-OH
，后续核苷酸不能连
接，核苷酸链不能延伸。最后得到一系 列小片段，电泳。

（
1
）
DNA
复制是以一条链为模板， 按碱基配对的原则进行的。脱氧
核糖的连接是以

3’
?
5’

磷酸二脂键

（
2
）复制反应可以在体外进行。



(3)< br>反应体系中包括：单链模板、
dNTPs
、合适的引物、一定比例的
2 ?
, 3 ?
-
双脱氧核苷三磷酸（
ddNTP)
以及若干种适量的无机离子。

（
4
）
2
’
和
3
’
双脱氧的
dd NTP
会使复制反应终止。


(5)
凝胶电泳分离
DNA
单链片段时，小片段移动快，大片段移动慢。

2
、
Maxam- Gilbert
化学修饰法
(
化学降解法
)
八、基因芯片（
Gene Chip
）

在固体支持物上高度密度排 列的
DNA
片段或寡核苷酸链，
又称
DNA
微阵列或寡核苷酸微阵列 。

技术原理：
一种大规模集成的固相杂交，
指在固相支持物上原位
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合成寡核苷酸或直接将大量预先 制备的
DNA
探针以显微打印的方式
有序地固化于支持物表面形成阵列，
然后 与标记的样品杂交。
通过杂
交信号检测样品的遗传信息
(
基因序列及表达的信 息
)
。

基因芯片的应用：①
DNA
测序

②基因表达分析

③基因诊断

④基因突变：

⑤药物研究与开发

九、基因突变技术

基因突变
（
gene mutation
）
:
基因组
DNA
分子在结构上发生碱基对组
成或排列顺序的改变，
并引起个体表型的改变，< br>而使生物体发生遗传
变异。

特异性突变：
寡核苷酸介导的基因突变；
盒式突变；
PCR
点突变；
基因合成。

1
、寡核苷酸介导的基因突变（
p38
）


原理


使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作为引物，
启动单链
M13
噬菌体
DNA
进行复制，
随后这段寡核苷酸引物便成 为
新合成
DNA
子链的一个组成部分，新合成的子链便具有发生突变的
碱基序 列。

2
、盒式诱导突变（
cassette mutagene
）
----
片段取代法（
p39
）








以各种双链质粒
DNA
为载体，采用人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段置换待改造基因中两个不同限制酶 切点之间的序
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列，在转化的大肠细菌中可形成数量众多的突变体。
这些合成的突变
片段就好像不同的盒式录音 磁带，
可随时插入准备好的质粒中，
称为
盒式突变。

3
、
PCR
点突变技术



PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过
PCR
扩增而获得定点突变的基因 或
DNA
片段。

第二章

一、限制性核酸内切酶（
Restriction
endonuclease
）一类能够识别双
链
DNA
分子中的某种特定核苷酸序列（
4
—< br>8bp
）
，并在相关位置切
割
DNA
双链的核酸内切酶。
限制性内切酶的类型：
I
型、
II
型、
III
型限制性内切酶


。

II
型酶就是通常所说的
DNA
限制性核酸内切酶。

限制性内切酶的命 名原则：基本名称：微生物的属名第一个字母大
写斜体，种名的前两个字母小写斜体。取变种或品系的第 一个字母。
该微生物中发现的酶的顺序按照罗马字母顺序编写
I
、
II
、
III
等。
（填
空题）

同裂酶：异源同工酶
:
来源不同，但具有相同的识别序列的限制性内
切酶。

同尾酶
(I socaudamer
）
来源不同，
识别序列不同，
但是切割
DNA
分子
所得的
DNA
片段具有相同的粘性末端。

杂交位点（
hybrid
site
）
：同尾酶切割
DNA
产生的末端连接后所形成
的新的位点。

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同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的
酶识别。

识 别位点在
DNA
分子中的频率计算：理论上有
n
个核苷酸的识别序
列 的酶出现概率为
1/4
n
。

星号活力（

Star activity
）
:
在非标准条件下，切割一些与特异识别序< br>列类似的序列，
降低酶切反应的特异性，
这种现象称为酶的星号活性
记作
: EcoRI*
。

影响限制性内切酶活性的因素：

1.
DNA
的纯度

：①纯化
DNA


②加大酶的用量

1ugDNA
用
10U
酶


③延长保温时间



④

扩大反应体积（

>20
?
l
）

2.
DNA
的甲基化程度


：基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的
菌株

3.
温度



不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是
37
oC
，少数要求
25-30oC
或
50-65 oC
4.
缓冲液：商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。

二、连接酶

基 因克隆实验中常用的
DNA
连接方法：
（
P102
）

a
、
同聚物加尾连接


用末端转移酶在载体和双链
DNA
的
3'
端各加一
段寡聚核苷酸
,
制成人工粘性末端

b
、
衔接物连接法


原理：
（
1
）
T4DNA
连接酶连接
linker
与克隆
DNA
片段。
（
2
）限制性内切酶消化具有衔接物的
DNA
分子和载体分子，
产生出互补粘性末端，进行粘性末端的连接。

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c
、
接头连接法原理：
接头平末端与平末端的外源
DNA
片段连接之后，
使后者成 为具有粘性末端的新的
DNA
分子，而易于连接重组。


d
、黏末端连接


e
、平末端连接

连 接酶连接作用发生在双链
DNA
上切口处的磷酸二酯键。而不能连
接两条单链
DNA
或双链
DNA
中缺失了核苷酸的缺口。

三、
DNA
聚合酶

DNA
聚合酶
I
的主要用途：
切口平移
(nick tra nslation)
法标记
DNA
（制
备
DNA
探针）：

原理
:
双链
DNA
在
DNA
酶< br>I
的作用下行成单链切口，
DNA
聚合酶
I
利用
5< br>’
?
3’
外切活性从切口的
5
’
端逐步水解核苷酸时 ，
酶的聚合活性
则利用切口的
3
’
游离羟基逐个加上相应的核苷酸， 使得切口向下移
动。
这种切口移动的现象称为切口平移。
如果反应中使用的单核苷酸< br>底物是用同位素标记过的，则产物
DNA
分子既可作为带放射性的
DNA
分子杂交探针。

（利用
DNA
聚合酶
I
的
5 ’
?
3’
外切酶活性和
5’
?
3’
的聚合酶活性。
）

Klenow fragment(Klenow
聚合酶
)
由
DNA Pol I
经枯草杆菌蛋白酶处理
产生的。


性质
:
具有
5’
?
3’
聚合酶活性和
3’
?
5’
外切 酶活性。

T4
DNA
聚合酶的性质：
5’
?
3 ’
聚合酶活性和
3’
?
5’
外切酶活性（降
解单链更快）< br>。

逆转录酶：依赖
RNA
的
DNA
聚合酶（
RNA
指导的
DNA
聚合酶）
。
作用：
具有
5’
?
3’
聚合酶活性；
具有
RNaseH
活性，
双向 外切
DNA-RNA
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杂合链中的
RNA
链。

?

用途：构建
cDNA
文库

四、
DNA
修饰酶

1
、
S1
核酸酶


特点：高度单链特异性：

降解单链
DNA
或
RNA
，
降解
DNA
速度大于
RNA
速度；
内切或外切；
需
pH4.0-4.3
环境，
Zn2+
激活

2
、碱性磷酸酶：来自于小牛肠（
CIP
）或大肠杆菌（
BAP
）
，用 于去
掉
DNA or RNA
分子的
5’
端的磷酸基团。


功能

：防止线性化的载
体份子自我连接

3
、
T4
多核苷酸激酶（
T4-PNK or T4-PNP
）催化
?
磷酸从
ATP
转给双
链或单链
DNA
或
RNA
的
5’
-OH
端。


用途：
DNA 5
’
-OH
端磷酸化、
标记
DNA
的
5
’
端。
（
1
）正向反应（
2
）交换反应。

4
、末端脱氧核苷酸转移酶（
TdT
）
< br>不需要模板的
DNA
聚合酶，在
DNA
分子的
3
’< br>末端

增加一个或多个脱氧核苷酸。


特点：①

需要
3’—
OH
。②

不需要
模板！③

底物可以是单链
DNA
、

3’
--OH
端突出的双链
DNA
、平
末端
DNA
。④

随机添加的
dNTPs，如只有一种
dNTP
，则添加同聚
物。

第三章


基因工程载体

1
、载体

（
Vect ors
）在基因工程操作中，把能携带外源
DNA
进入受
体细胞的
D NA
分子叫载体。

2
、基因工程对载体的要求：
（
1）在宿主细胞内能独立复制，
ori
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（
2
）有选择性标记

Ampr
、
Tetr
、
Kanr
等。

（
3
）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点

（
4
）分子量小，可容纳较大的外源基因片段

（
5
）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。

（
6
）具有对受体细胞的可转移性

（
7
）具有较好的安全性，不能任意转移

3
、质粒载体






质粒
（
plasmid
）
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状
DNA
分子（
Covalently Closed Circular DNA, ccc DNA
）
。

质粒
（
plasmid
）
的 基本特征：
1
、
自主复制性


松弛型复制质粒
（
relaxed
plasmid
）
和严紧型复制质粒

（
stringent plasmid
）


2
、
可转移性


这
种转移依赖于质粒上的
mob
基因产物。


3.
质粒的不相容性
(incompatibility,
又称不亲和性
)



4
、携带特殊的遗传标记

质粒的
CCC
分子可有不同的构型：
SC
构型，
OC
构型和
L构型

质粒的分离纯化
P60
(1).CsCl
密度梯度离心 法原理：

能够嵌入
DNA
的碱基对之间，
不同构型
DNA< br>分子结合
EB
的量不同，从而密度不同。
2.
完整的超
螺旋质 粒没有自由末端
,
解链比较困

难，结合
EB
的量少，密度 较大
.
线形的
DNA
和开环的质粒
DNA
由于松弛，可以< br>
结合较多的
EB
分
子，则密度小
.

浓度达到饱和时，超螺旋质粒
DNA
分子密度大
于线形和开环的质粒
DN A
，从而分开。

（
2
）
、沸水浴法

制备的质粒不纯，收率低，制备规模小，但快速，
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特别适用小量提取质粒。


（
3
）
.
碱裂解法

质粒构建原则：
1
、选择合适的出发质粒

2
、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、
PCR
3
、组装合适的选择标记基因

4
、选择合适的启动子

5
、提高外源
DNA
的容量

6
、需要灭活出发质粒上的某些编码基因

7
、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单

质粒载体的类型的选择：
（
1
）高拷贝数的质粒载体

：

适合大量增殖
克隆基因

（
2
）
低拷贝数的质粒载体

：
适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的
基因。

减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。

（
3
）失控的质粒载体：一些低拷贝基因是温度敏感型

（
4
）

插入失活型质粒载体：
载体的克隆位点位于其某一 个选择性标
记基因内部。
外源
DNA
片段插入会导致选择记号基因
（ 如
tetr
、
ampr
、
cmr
等）失活。

（
5
）
正选择的质粒载体

：
质粒载体具有直接选 择记号并赋予寄主细
胞相应的表型。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养
基上生长。


（
6
）

表达型质粒载体：含有强的启动基因，合适的顺序以及有效的