基因敲除

2021年2月28日发(作者：甲肝灭活疫苗)
基

因

敲

除

一、基因敲除简介

基因敲除是上个世纪
90
年代出现的最新外源< br>DNA
导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基
因的同源重组。指外源DNA
与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因
组 中的相同
/
相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正 确纠正机体的
基因突变。

二、基因敲除的方法及原理

1
．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的
DNA
分子都重组到带有标记基因
（如：
neo
基因）
的载体上，
成为重组载体。将重组载体通过一定的方式 （如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（
EScell
）中，使外源
DNA
与 胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。
将重组载体中的
DNA
序列整合到内源基 因组中，
从而得以表达。
动物的重组概率为
10
-2
~10
-5
，植物的概率为
10
-4
~10
-5
，如何从众多细胞 中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细
胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法
(PNS法
)
，标记基因的特异位点表达法以及
PCR
法。其中应用最多
的是
PNS
法。

通过观察嵌和体小鼠的 生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改
变，达到研究目的基因的目的。由 于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中
,
所以如果要得到稳定遗
传的纯合 体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

例题
(18
分）

1.

基因敲除自
20
世纪
80
年代末发展起来 ，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基
因敲除技术之一的示意图：


1
该技术的主要步骤及应用如下：

（
1
）第 一步是构建打靶载体，把
2
个标记基因（新霉素抗性基因
neo
和单纯疱疹病 毒胸苷激酶基因
HSV - TK
）
插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体 中，使目的基因
__________
。

（
2
）
第二步是将打靶载体通过
________________
技术导入
ES
细 胞中，
失活的目的基因替换
ES
细胞染色体上待
敲除的基因，以达到基因敲除 的目的。

（
3
）第三步是用选择培养基筛选靶
ES
细胞。 用含
_____________
的培养基筛选所有能表达
neo
基因的细胞 ，用
含
GCV
的培养基
______________
所有能表达< br>HSV - TK
基因的细胞（含
HSV - TK
基因的细胞能将无毒的
GCV
转化成有毒的药物）。

（
4
）第四步是将筛选出来的靶
ES
细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入
_______________
体内，使其发育成
嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与
___ ______
小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠。

（
5
）
通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，
可以达到研究
________
的目 的；
通过敲除抗原决定基因，
还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除
_____ ___
。

答案：














2.
研究者取野生型小鼠（Ⅰ
Ⅰ
)
的胚胎干细胞，转入含
neo
基因（ 新霉素抗性基因）的
DNA
片段，定向突变Ⅰ
+
-
基因（结果如图< br>1),
再将突变的胚胎干细胞移回野生型小鼠胚胎，培育出带突变基因（Ⅰ
）的杂合子小 鼠。

+
+
r

(1)
将外源
DNA
片段导入胚胎干细胞后，需用含

的培养基培养细胞，以筛选得到突变的胚胎干细胞。

(2)
用此杂合体小鼠 与野生型小鼠进行杂交实验，并通过
DNA
分子杂交技术检测小鼠的基因型，结果如图
2
。

2

①检测小鼠的基因型，需根据

序列设计
DNA
分子探针。根据杂交实验结果推测，
I
基因的功能是 与


有关。

+
-
②分析系谱图
(
能
/
不能）判断Ⅰ
、Ⅰ
基因的显、隐性，理由是
.
③只有突变基因来自
(
父本
/
母本）
时 ，
杂合子小鼠才表现出发育迟缓，
由此推测来自

的
I
基因在
体细胞中不表达。

r
④提取小鼠体细 胞的总
RNA,
加入
Actin
基因（编码细胞骨架蛋白）和
net
基因的
RNA
探针，之后加入
RNA
酶水
解单链
R NA
。若探针能与细胞样品的
RNA
结合成双链
RNA
则不被酶水解 而保留，电泳分析时呈现明显条带（在记
录实验结果时，有明显条带用“
+
”表示，无 明显条带用“一”表示
)
。请将支持③推测的实验结果填入下表ⅰ、
ⅱ、ⅲ处。


(3)
杂合子小鼠雌雄个体交配，则后代的表现型及比例为

。

答案
(18
分，每空
2
分）

(1)
新霉素

(2)
①外显子
2
和
neo
基因

生长发育

②不能

杂合子小鼠既有体型正常的，又有发育迟级、体 型瘦弱的，无法判断性状的显、隐性，所以也无法判断Ⅰ
、Ⅰ
‘基因的显、隐性

③父本

母本

④ⅰ
:
一、ⅱ：
+
、ⅲ：一

(3)
野生型：发育迟缓型
=1:1
+
-
r
3.
（
16
分，除特殊说明每空
2
分，图解
2
分）


3

科研工作者利用胚胎干细胞和基因敲除技术改造老 鼠体内的特定靶基因，
使实验鼠体内的靶基
因失去作用，
从而发现这些基因的实际功能 ，
这种技术的应用，
使我们能够更深入地了解胚胎发育、
老化以及疾病的过程。基因敲 除主要是应用
DNA
同源重组原理，用设计的同源片段（部分序列与
靶基因相同，从而 使该片段特异性插入靶基因）使靶基因突变而达到基因敲除的目的。原理如图：

科研工作者获取稳定遗传的纯合体基因敲除小鼠一般经历下列过程：

(1)
获取干细胞悬浮液

科学家将动物胚胎组织用













处理使其细胞离散

，再通过
CO
2
培养箱培养 胚胎干
细
胞
。
CO
2
的
作
用
是< br>
















；
胚
胎
干
细
胞
分
化
为
不
同
组
织
器
官
的
原
因
是



































。

(2)
构建重组
DNA
分子

构建含有“同源性片段”的重组
DNA
分子时要用到的工具酶有
















；该实验
病毒的作用是
_____________
。


（
3
）获取含重组基因的干细胞

基因转移的同源重组自然发生率极 低（动物的重组概率为
10
-2
～
10
-5
），因此
“
同源性片段
”
含有的标记基因作用非常重要，
可采用
_____ _____________
技术检测或利用选择培养基筛选。
靶基
因被插入同源性片 段后发生基因突变，
该特异性插入突变克服了自然诱发突变或人工物理、
化学诱
发突变 的
______________
特点，便于专一性研究靶基因的功能。

4
（
4
）将重组的胚胎干细胞通过显微注射技术导入胚泡（囊胚中），然后将胚泡植入受 体小鼠子宫
中
，
获
取
子
代
嵌
合
体
小
鼠
。
其
中
一
些
子
代
小
鼠
的
配
子
不
含
无
活
性
基
因
，
原
因
可
能
是
___________ _____________________________
（答出
2
点）
。
X
代中含有无活性基因的雌鼠和雄鼠
均为
______________ ___
。


（
5
）获取基因敲除纯合子小鼠
< br>假设已获取
1
只雌性基因敲除杂合子小鼠。
用遗传图解表示利用该鼠通过杂交实 验获得纯合基
因敲除小鼠的过程。（靶基因用
A
表示，插入同源片段的靶基因用
A
+
表示

）

答案
（
18
分，除特殊说明每空
2
分）

⑴胰蛋白酶（
1
分）






调节
pH
（
1
分）






基因的选择性表达

⑵限制性内切酶、
DNA
连接酶

（缺一不可）



载体

⑶


DNA
分子杂交







随机性和不定向性（
1
个
1
分）

⑷

子代小鼠可能为杂合子；

重组胚胎干细胞未分化为精原细胞或卵原细胞


杂合子

⑸



P











♀AA




+




×

AA♂



（
1
分）










F
1















AA
+




AA



（
1
分）















自交

+
解析：
因为只获取
1
只雌
性 基因敲除嵌合鼠，
所以
第一步不能自交；
F
1
获得
多只雌、
雄基因敲除嵌合
鼠




F
2


A
A




2AA
+
+


AA


（
1
分）





2. RNA
干扰技术（
RNA interference
，
RNAi
）引起的基因敲除：

RNA i
是一种普遍的转录后基因沉默的机制。由于少量的双链
RNA
就能阻断基因的表达， 并且这种效应可
以传递到子代细胞中
,
所以
RNAi
的反应过程也可 以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了
RNAi
这种更为简单方便的方法。





3.
利用随机插入突变进行基因敲除

利用某些能随机插入基因序列的病毒，
细菌 或其他基因载体，
在目标细胞基因组中进行随机插入突变，
建立
一个携带随机插入突变 的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同，逆转录病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言，
农杆菌介导的
T-DNA
转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。





( 1 ) T-DNA
简介及相关例题

T-DN A
也叫三螺旋
DNA
，是指一种由三股
ssDNA
旋转螺旋行成的一 种特殊结构。

另外，
T-DNA
也叫
transferred
DNA
。是
Ti
质粒上的片断，
T
－
DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制
合成植物生长素与分裂素，
促使植物创伤组织无限制 地生长与分裂，
形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱。
T-DNA
技术是构建 突变体库，反向遗传学的突破性技术之一。

T-DNA
是农杆菌
Ti(tumor
inducing)
或
Ri(root
inducing)
质粒中 的一段
DNA
序列，可以从农杆菌中转移并
稳定整合到植物核基因组中。农杆菌
Ti(tumor
inducing)
或
Ri(root
induci ng)
质粒已成为植物分子生物学中广
泛应用的遗传转化载体。
T-DNA
是
Ti
质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（主要是双子叶
植物）时 分别诱发根瘤，
opine
化合物的合成和抑制细胞分化。
Ti
质粒因为自 身一些优点很适合作为导入外源
基因的载体，而外基因就是整合到
T-DNA
上的。< br>
5
一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或病毒来充任，

而在众多的载体中目前仅有
Ti
质粒在转化植物受
体方面取得较多的成功。所以
Ti
质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统。农杆菌侵染植物后，
Ti
质粒
中的
T-DNA
区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体上。
因此，
如果把外源基因插入
T-DNA
中，
就有可能携带
进入受体植物并整合到染色体上。

例

题

1.
（
16
分）
利用农杆菌转化法，将抗逆基因转入至拟南芥（
2n=10
）中，获得不同株系的拟南芥。

（
1
）
从农杆菌中获得带有潮霉素抗性基因
（
H
基因）
的
Ti
质粒，
将抗逆基因插入到
Ti
质粒的















上，
因
Ti
质粒上的此结构具有















的特点。

（
2
）为确定不同拟南芥株系导入的基因在染 色体上的相对位置，科研人员筛选并通过自交获得转基因成功的
4
个纯合株系：
1、
2
、
3
、
4
，做了如下杂交实验。


①
4
个纯合株系植株分别与非转基因植株正、反交得
F1
，
F
1
自交获得
F
2
。
F
2
中抗潮霉素性状与不抗潮霉素
性状的植株比例为















，表明每个株系的
H
基因均位于一对同源染色体上的同一位点，但不
能确定
4
个株系的
H
基因是否位于同一对同源染色体上。


②将上述
4
个纯合株系植株间进行配组形成
6
个杂 交组合（
1×
2
、
1×
3
、
1×
4
、
2×
3
、
2×
4
、
3×
4
） ，每个组合
得
F
1
，
F
1
自交获得
F2
。




a
．除
2×
4
组合外，其它杂交组合
F
2
中抗潮霉素性状与不抗潮霉素性状的植株比例均为
15:1
，表明
1
、
2
、
3
三个株系相比 较，它们的
H
基因位于















（同源染色体
/
非同源染色体）上。



b
．
2×
4
组合
F
2
植株全表现抗潮霉素性状 。假设株系
1
中
H
基因在染色体上的位置如图
1
所示，请推 测株
系
2
中
H
基因的位置和株系
4
中
H< br>基因的两种可能的位置（在图
2
中标注，竖线代表染色体，横线代
表基因的位置 ）。











（第一种可能位置）

（第二种可能位置）

图
1
图
2

固定）的。

（
3
）潮霉素抗性可作为转基因植株后代具有抗逆基因的初步判断指标。实验中发现上述纯合株系自交后代 的抗
逆比例未达到
100%
，可能的原因是















。

答案（
16
分）

（
1
）
T-DNA









可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体
DNA
上

6
H
H
株系
1
株系
2
株系
4
株系
4






c
．根据上述实验推测，利用农杆菌转化法导入到拟南芥中的基因的插入位置是















（随机
/
（
2
）①
3:1
②
a.
非同源染色体



b.
（
4
分）



c.
随机

（
3
）抗逆基因丢失或抗逆基因未表达（合理给分）


2.
（
18
分）科研人员将
T-DNA
片段（< br>T-DNA
的区段带有潮霉素抗性基因）插入正常株（野生型）水稻愈伤组织单
个染色体
DNA
中，导致被插入基因（
PIN
蛋白基因）发生突变，得到矮杆水稻（突 变型）
Q
。科研人员利用矮杆
突变体
Q
进行自交得到
F1
：

（
1
）统计
F
1
代植株的株高，并剪取其叶片在含

选择培养基进行筛选，统计实验结果如下表。

潮霉素抗性

抗性

非抗性

F
1
植株性状

矮杆

258
0
正常株高

0
85
图
2

据表分析，说明矮杆突变体性状是

性性状，水稻的株高是由

对等位基因控制的，判断依据
是

。

F
1
矮杆植株自交得到
F
2
，F
2
中矮杆性状所占比例为

。

（
2
）
已有研究表明
PIN
蛋白与生长素的极性运输有关。
研 究者据此推测
T-DNA
片段的插入导致

（选
“矮
杆水稻”或“正常水稻”）
PIN
蛋白基因的表达量

，从而造成生长素的极性运输水平下降，植株
中出现矮杆性状。

（
3
）为验证上述推测，研究者首先需要从水稻叶片中提取总
RNA
，经

过程获得
cDNA
；再根据
PIN
蛋白合
成基因的

设计引物，定量扩增
PIN
蛋白合成基因，得出样品中
PIN
蛋白合 成基因转录出的
mRNA
总量；最终比较
PIN
蛋白基因在正常水稻和矮杆水 稻细胞内的表达量。

（
4
）为证明“
PIN
蛋白定位于植 物细胞膜上”，研究者实验设计的核心步骤及预期实验结果是

（填
字母）。


基因与绿色荧光蛋白基因融合与质粒构建重组
DNA
7
b.
已知细胞膜蛋白基因与红色荧光蛋白基因融合构建重组
DNA
c.
用显微镜观察，细胞膜上仅出现红色荧光

d.
用显微镜观察，细胞膜上仅出现绿色荧光

e.
用显微镜观察，细胞膜上出现红色和绿色荧光

答案（
18分，除标出的每空
1
分外，其余每空
2
分）

（
1
）潮霉素

显—
1
分
1
—
1
分
T2
代矮杆：正常杆
=3:1
的分离比
5/6
（
2
）正常水稻

下降

（
3
）逆转录

碱基排列顺序

（
4
）
abe

3.
（
22
分 ）烟草是一种种植历史悠久的作物，可以采用不同方式进行育种。

（
1
）现 有甲、乙两种烟草（
2n=24
），二者远缘杂交不亲和。研究人员用甲、乙植株进行了体细胞 杂交，将叶肉
细胞去除细胞壁制成

，
在促融剂

的诱导下，
融合成为杂种细胞并最终培养成杂种植株。
在
杂种植株中发现有一 株体细胞染色体数目为
47
条的丙植株，将丙与甲植株进行杂交，
F
1
中一些植株（丁）体细
胞含有
35
条染色体，
其中有
22
条染色体在减数分裂时能联会，
其余不能联会，
由此推测丙植株所缺失的染色体
属于< br>
（填
“甲”
或
“乙”
）
植株。
如果所缺失的那条染色体属于另一植株，
那么丁植株在减数分裂时应有

条
染色体能联会，其余

条染色体不能联会。

（
2
）甘蔗的蔗糖磷酸合成酶（
SPS
）活性直接反映了甘蔗体内蔗 糖合成的能力。研究人员将未突变和已突变的蔗
糖磷酸合成酶基因分别转入烟草中，测定比较了所得SPS
的活性，为作物的改良提供了一定的依据。

①甘蔗中控制
SPS
合成的基因简称
SPS3L
，
研究人员利用特定的试剂和技术手段将
SPS3L
基因相关位点的碱基
TCA
突变成
CGA
，
从而 使
SPS
的第
153
位丝氨酸变为丙氨酸，
而其他氨基酸均无改变，
此种突变基因称为
SPS3L-A
型。
由此推测在人工的处理下，
S PS3L
基因中的碱基可发生

（填“定向”或“不定向”）改变 。另两种突
变型（
SPS3L-T
型、
SPS3L-G
型）也用此方 法获得。

②将目的基因与含有潮霉素抗性基因的
Ti
质粒构建基因表达载体 ，采用农杆菌转化法导入烟草细胞，利用

技术进行培养。培养基中除含有必要营养物质、植物激素和琼脂外，还必须加入

进行筛选。若要检测
目的基因是否导入烟草细胞，可采用


技术或
PCR
技术进行检测。

③取上述已成功导入目的基因的新鲜烟草，分别测定叶片的可溶性糖含量，结果如图所示。



四种转基因烟草中，
导入

的是对照组，

型的烟草叶片可溶性糖的含量与之相比没有发生明显变化，
推测在
153
位的丝氨酸虽然被替代，
但
SPS< br>的活性

。
由测定结果可以看出

型
SPS
活性最高，最适合用来改良作物。

答案（
22
分）

（
1
）原生质体

聚乙二醇

甲
24 11

（
2
）①定向

②植物组织培养

潮霉素
DNA
分子杂交

8