基因诊断方法

2021年2月28日发(作者：锰)
第二十一章



基因诊断与基因治疗

基因诊断 与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学
的理论及技术方法，特别是 重组
DNA
技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、
克隆及分析目标基因 。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因
此在
20
世纪< br>70
年代末诞生了基因诊断
(gene
diagnosis)
；随后 于
1990
年美国实施了第一个基
因治疗
(gene therapy)的临床试验方案。
可见，
基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和
技术与医 学相结合的范例。

第一节

基因诊断

一
.

基因诊断的含义

传统对疾病的诊断主要是以疾病的 表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变
化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多 情况下不是特异的，而且是在疾病发生
的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种 表型的改变是由基因异常
造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生 物学的技术
方法来分析受检者的某一特定基因的结构（
DNA
水平）或功能（
RNA
水平）是否异常，以此
来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或
DNA
诊断
(DNA
diagnosis)
。基因
诊断是病因的 诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而
可以对表型正常的携带者及 某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族
史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因 的检测具有指导意义。

二
.

基因诊断的原理及方法

（一）基因诊断的原理

疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异 常有关。基因诊断的基本
原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是
RNA
产物 是否正常。由于
DNA
的突变、
缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构 变异，因此，可以直接检测上述的变
化或利用连锁方法进行分析，这就是
DNA
诊断。

对表达产物
mRNA
质和量变化的分析为
RNA
诊断(RNA
diagnosis)
。

（二）基因诊断的方法


1




基因诊断是以核酸分子杂交
(nucleic acid molecular hybrid ization)
和聚合酶链反应（
PCR
）
为核心发展起来的多种方法，同 时配合
DNA
序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为
一种很有用的基因诊断方 法。

1.

DNA
诊断

常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。

⑴

斑点杂交：根据待测
DNA

样本与标记的
DNA
探针杂交 的图谱，可以判断目标基因
或相关的
DNA
片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解 待测基因的数量。

⑵

等位基因特异的寡核苷酸探针（
allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe
）杂交：
是一种检测基 因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约
19
个核苷酸
长度的 片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交
条件下，只有该点突 变的
DNA
样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形
成杂交点。一 般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受
检的
DNA
样本只能与突变
ASO
探针，不与正常
ASO
探针杂交，说明受检二条染色 体上的基
因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变
ASO
探针又能与正常< br>ASO
探针杂交，
说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这 种突变基因的杂合子；
如果只能与正常
ASO
探针杂交，不能与突变
ASO< br>杂交，说明受检者不存在该种突变基因，
如图
21-1
所示。

若与
PCR
方法联合应用，即
PCR/ASO
探针杂交法
(PCR /ASO
probe
hybridization)
，是一
种检测基因点 突变的简便方法，先用
PCR
方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与
ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中
海贫血、
苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。
也可分析癌基因如
H-
ras< br>和抑癌基因如
p53
的点突变。

⑶

单链构象多态性（
single strand conformation polymorphism, SSCP
）分析相同长度的单
链
DNA
因其序 列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳时速度就不同，若单 链
DNA
用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设
计引物对突变点所在 外显子进行扩增，
PCR
产物经变性成单链后进行电泳分析。
PCR/SSCP
方

2
法，能快速、灵敏、有效地检测
DNA
突变点，如图21-2
，此法可用检测点突变的遗传疾病，
如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基 因和抑癌基因。

⑷

限制性内切酶图谱（
restriction map
）分析，如果
DNA
突变后改变了某一核酸限制性
内切酶的识别位点， 使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内
切酶片段的长度和数目会发生改变 。
一般基因组
DNA
经该种限制性内切酶水解，
再做
Souther n
印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图
21-3
所示。如果用
PCR
扩增该突变点的
外显子，
PCR
产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳 ，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小
及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾 病，如镰状细胞贫血。或
基因缺失的疾病如
α
地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等 。

⑸

限制性片段长度多态性（
restriction fragment length polymorphism ,RFLP
）遗传连锁分
析人 群中个体间
DNA
的序列存在差异，据估计每
100-200
个核苷酸中便有
1
个发生突变，这
种现象称为
DNA
多态性。有些
DNA< br>多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生
了
DNA
限制性片段长度 多态性。
RFLP
按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一
致病基因与特定 的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，
来判断该家庭成员或胎儿的 基因组中是否携带该致病基因，见图
21-4
，此法可用于诊断甲型
血友病、苯丙酮尿 症、享延顿舞蹈病等。





⑹

D NA
序列分析对致病有关的
DNA
片段进行序列测定，
是诊断基因异常
（已知和未知）
最直接和准确的方法。

2.

RNA
诊断

RNA
诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的 质和量，以判断基因转录效率的高
低，以及转录物的大小。

⑴
RNA
印迹（
Northern
blot
）
R NA
印迹是检测基因是否表达，表达产物
mRNA
的大小的
可靠方法，根据杂 交条带的强度，可以判断基因表达的效率。

⑵
RT-PCR
是一种检测基因 表达产物
mRNA
灵敏的方法，若与荧光定量
PCR
结合可对
RT- PCR
产物量进行准确测定。

三
.

基因诊断的应用


3
（一）遗传疾病

现知遗 传疾病有数千种，但多数遗传疾病属少见病例，有些遗传疾病在不同民族，不同
地区的人群中发病率不同 ，例如镰状细胞贫血（
sickle cell anemia
）
,
非洲黑色 人种发病率高，
而囊性纤维化症（
cystic fibrosis
）常见于美国白色 人种，这二种遗传疾病在我国为罕见病例。
中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友 病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养
不良症（
DMD
）
、葡萄糖
-6
磷酸脱氢酶（
G-6PD
）缺乏症、唐氏综合症（
Down
’
s
syndrome
）
等。

根据不同遗传疾病的分子基础，可采用不 同的技术方法进行诊断，不但可对有症状患者
进行检测，而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚 至胚胎着床前（
preimplantation
）
进行诊断是否携带有异常基因，这 对婚育具有指导意义。

地中海贫血（地贫）是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病（
monogenic
disease
）
,
由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致
α
类与
β
类珠蛋白不平衡造成的，临床以贫血、
黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征，地贫 最常见的有两类：
α
地贫和
β
地贫。

α
地贫(
α
-thalassemias)
的分子基础主要为
α
珠蛋白 基因缺失，也有部分病例是由于碱基
突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测
α
珠蛋白基因的缺失。

人
α
珠蛋白基因簇位于
16
号染色体，长度
29
kb
，包含
7
个连锁的
α
类基因或假基因。
α
基因
（
α
1
及
α
2
编码序列相同，
仅非编码序 列稍有差别
,
产物相同）
，
该基因簇上有
2
个
Ec o
RI
识别位点，经
Eco
RI
酶解，进行
Souther n
印迹，用标记的
α
基因片段作探针，得到一条
23 kb
的杂交条 带，
Bam
HI
识别位点有
4
个，
但只有
14 k b
片段能与
mRNA
基因探针杂交，
见图
21-5
。

Hb Bart
’
s
胎儿水肿综合征：由于该病患儿二条
16< br>号染色体的
4
个
α
珠蛋白基因均缺失，
不能合成
α< br>链，胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常于妊娠
30
－
40
周死亡 或早产后半小
时内死亡。样本
DNA
经限制性内切酶图谱分析不能显示
α珠蛋白基因区带，
RNA
诊断也测
定不出有
α
珠蛋白基因的mRNA
。

缺失型
HBH
病：由于一条
16
号染色体上的两个
α
珠蛋白基因均缺失，另一条
16
号染色
体上则缺 失一个
α
珠蛋白基因，并缺失
3.7 kb
长度的
DNA
片段（右侧缺失型）或
4.2 kb
片段
（左侧缺失型）
，
DNA
诊断只产生
19 kb
长度的
Eco
RI
片段，或
10kb
Bam
HI
片段。


4
标准型
α
地贫 ：一条
16
号染色体上
2
个
α
珠蛋白基因全部缺失。而另一 条
16
号染色体
上具有
2
个正常的
α
珠蛋白基因，
DNA
诊断结果，
Eco
RI
和
Bam
HI
都出现与正常一样的
23 kb
或
14 kb
的条带，但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。

β
地贫
(< br>β
-thalassemias)
的基因诊断：
β
地贫的分子基础不同 于
α
地贫，
β
珠蛋白基因通
常并不缺失，而是由于基因点突变或个别 碱基的插入或缺失。每一民族和人群
β
珠蛋白基因
点突变部位不尽相同，都有特定的类 型谱。

（二）感染性疾病





过去对感染性疾病
(infectious
diseases)
的诊断，一 是直接分离检查病原体，或者对患者血
清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需经过长期 培养才能获得。血清学对
病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出 现抗体，并
且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体< br>的检查有困难。





对感染性疾病的基因诊断 具有快速、灵敏、特异等优点。
80
年代建立的
PCR
技术已广泛
应 用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成
ASO
探针，对病原体的
DNA
可用
PCR
技术直接检查，而对
RNA< br>病毒，则采用
RT-PCR
。现在市场
已经有许多种病原体的测定药盒供应，每 一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以
及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。

1.

病毒性感染：

多种病毒性感染都可采用基因诊断 检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎
病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病 毒、腺病毒、
EB
病毒、疱疹病毒、人巨
细胞病毒、乳头状病毒??等。最近新发现的
SARS
冠状病毒，在基因组（
RNA
）序列确定
后，便很快建立了
RT-PCR
的基因诊断法。

2.

细菌性感染：

可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠 杆菌、霍乱弧菌、
淋球菌、绿脓杆菌??等。

3.

寄生虫：


5
恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫??等都有基因诊断的方法

4.

其它
:
如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。

（三）恶性肿瘤

分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑 癌基因的丢失或突
变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断，对肿瘤治疗及预后有指 导意
义。

(
四
)
法医学中的应用

对生 物个体识别和亲子鉴定传统的方法有血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜抗
原
(HLA)
等，但这些方法都存在着一些不确定的因素。近年来对人基因结构的深入研究发现，
有些具有个 体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定。

1. DNA
指纹分析
(DNA
fingerprinting)
近年研究发现，人类基因组中许多位点存在着一种可变串联重复序列
(variable
number
of
tandem repeat
，
VNTR)< br>。
这种
VNTR
主要存在于基因的非编码区，
重复序列是头对尾串联排 列
着。人类某些
VNTR
是由
20-50
个重复单位组成，每个单位含
15-100 bp< br>，
DNA
的长度为
1kb
至
5kb
，较普通卫星DNA
（约
100 kb
）小，所以称为小卫星
DNA
（
minisatellite DNA< br>）
。经研
究发现
VNTR
有高度的多态性，在人群中的分布表现高度的 个体特异性，甚至同一个体同源
染色体的等位
VNTR
的重复单位数也不同，等位基因 按孟德尔方式遗传。
VNTR
区的重复单
位数目不同，所以该区的
DNA长度不同。但每一位点
VNTR
的核心序列却有高度的保守性，
因此可认为
VNTR
是一种判断个体的遗传标记。

1985
年，

Jeffreys
根据
VNTR
的特点，选择某些核心序列作为探针，并选用核心序列 无
切割位点的限制性内切酶如
Hin
f1
，对
DNA
样品进 行酶解，然后作
Southern
印迹。图谱显示
不同个体具有不同条带，如同人的指 纹具有高度的个体特异性一样，因此把这种
Southern
印
迹图称作
DN A
指纹图谱
(DNA

fingerprint)
，如图
2 1-6
所示。实验证明，除同卵双生子有相同
的图谱外，两个人不可能有完全相同的图谱，所以 这种方法对个体识别，亲子鉴定，嫌疑罪
犯的判断准确可靠。图
21-7
是引自文献报 道的结果。可是
Sourthern
印迹技术操作繁琐，所需
时间长，需要
D NA
量较大，若
DNA
降解还会影响对结果的判断。所以，
Jeffreys
又根据每一

6
VNTR
区翼侧保守序列设计引物，用
P CR
方法对该区进行扩增，因
VNTR
长度不同，所以产
物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后，根据条带的不同，可以判断结果。这种方法既方便又省时，
对部分酶解
DNA
也适用，对单根毛发，血斑，皮屑和精迹都可进行分析。但有些
VNTR
重复
片断较 长，
PCR
难以扩增。

2
．

短串联重复
(short tandem repeat,STR)
多态性分析




90
年代初，发现人基因组中存在着数量众多的
STR,
STR
的重复单元较短，核心序列含
2-4 bp
，
DNA
片段长度为
100-500 bp
，故称为微卫星
DNA
(microsatellite DNA).
与
VNTR
相同
,
有不少的微卫星
DNA
存在着个体间重复单元数目不同的多态性
,
所以是一种应用价值很高的
遗传标记。
又因为微卫星
DNA

较短，
易进行
PCR
操作，
也能适用于降解的
DNA
分析 。
目前，
STR-PCR
技术在法医学中的应用已占主导地位。

VNTR
和
STR
除在法医学中的应用外，还用于遗传作图
,
基因定位及遗传疾病的诊断等。

第二节

基因治疗

一
.

基因治疗的慨念

（一）基因治疗的定义

从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基
因的方法 。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达
从而达到治疗或预防疾 病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的
同源基因或与缺陷基因无关的治疗基 因。

基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（
somatic
gene
therapy
）
，
另一种是改变生殖细胞的基因表达，
即种系基因治疗（
germline gene therapy
）
，
从理
论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传
给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后
果，涉及一 系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体
细胞，基因型的改变只限 于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。

（二）基因治疗的方式

基因治疗的方式（
type of gene therapy
）主要有
3
类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷

7