基因工程知识点全

2021年2月28日发(作者：冰火避孕套)
第一章

基因工程概述

1?
什么是基因工程，基因工程的基本流程？

基因工程（
Genetic engineering
）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多

种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，

使之按照
人们的意愿遗传并表达出新的性状。

因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大

要素。

1.
分离目的基因

2?
限制酶切目的基因与载体

3.
目的基因和载体
DNA
在体外连接

4?
将重组
D NA
分子转入合适的宿主细胞
，
进行扩增培养

5.
选择、筛选含目的基因的克隆

6.
培养、观察目的基因的表达

第二章

基因工程的载体和工具酶

1.
基因工程载体必须满足哪些基本条件？

具有对受体细胞的可转移性或亲和性。

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。

具有合适的筛选标记。

分子量小，拷贝数多。

具有安全性。

2.
质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？

1
、

自主复制性

2
、

可扩增性

3
、

可转移性

4
、

不相容性

主要类型有
1.
克隆质粒
2.
测序质粒
3.
整合质粒
4.
穿梭质粒
5.
探针质粒
6.表达质粒

3.
质粒的构建

（
1
）

删除不必要的

DNA
区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源

DNA
片段的装载量。

一
般来说，大于
20Kb
的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。

（
2
）

灭活某些质粒的编码基因，

如促进质粒在细菌种间转移的

mob
基因，杜绝重组质粒扩
散污染环境，保证
DNA
重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因 ，

提高质粒
的拷贝数

（
3
）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受

体细胞。

（
4
）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的

DNA
序列，即

多

克隆接头（
Polylinker
），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一

化，以便环
状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。

（
5
）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。

4.
什么是人工染色体载体？

将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，

即可构成
染色体载体

5.
什么是穿梭载体？

人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、

可以在两种不同的寄主细胞中存活和

复制的载体。

6.
入
-
噬菌体载体及构建

hDNA
为线状双链
DN A
分子，长度为
48.5kb
，在分子两端各有

12
个碱基的单链互补粘

性末端。

1
缩短长度提高外源

DNA
片段的有效装载量删除重复的酶切位点

引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源

DNA
片段克隆的可操作性

灭活某些与裂解周期有关基因。

使入
-DNA
载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，

以避免可能出现的污染

现
象的发生。

加装选择标记，便于重组体的检测

7.
M13
单链噬菌体
DNA
载体

1 / 10


过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。

引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列

（
lacZ
'
）
的乳糖操纵子片段（

lac
）、组氨酸操纵子片段（

his
）以及抗生素抗性基

因等。

将人工合成的多克隆位点接头片段插在

lacZ
'
标记基因内部，

使得含有重组子的噬

菌斑呈白
色，而只含有载体

DNA
的混浊噬菌斑呈蓝色。

（
4
）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的

DNA
测序引物序列，使得重组

DNA
分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。

8.
II
类限制性内切核酸酶的特点

限制性核酸内切酶（

Restriction endonucleases
）是一类能在特异位点上催化双链

DNA
分子的
断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。

识别位点的特异性：

每种酶都有其特定的

DNA
识别位 点，通常是由
4
、
5
或
6
核苷酸

组成
的特定序列（靶序列）

。

识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈

回文结
构。

切割位点的规范性：双链

DNA
被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可

形成粘性末端或平末端的

DNA
分子）。

同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。

同裂酶：识别位点与切割位点
均相同的不同来源的酶称为同裂酶

同尾酶

（

Isocandamers
）：识别位点不同，

但切出的

DNA
片
段具有相同的末端序列，

这些酶

称为同尾酶。

9.
甲基化酶

H
类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，

甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，

并在识

别序列内使某位碱基甲基化，

从而封闭该酶切口。

甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的

同时，
却产生出另一种酶的切口

甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使

DNA
免受相应的限制性核酸内

切酶的切割。

甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。

10.
DNA
连接酶连接作用的特点
：

①

DNA
连接酶需要一条

DNA
链的
3
'
末端有一个游离的羟基（
-0H
）
,
另一条
DNA
链的5
'
末

端有一个磷酸基（
-P
）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接

DNA
分子的作用。

②

只有当
3
' -
0H
和
5
' -
P
彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱

氧核苷酸末端时，
DNA
连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。

③

DNA
连接酶不能连接两条单链的

DNA
分子或环化的单链

DNA
分子，被连接的
DNA
链必须是

双螺旋
DNA
分子的一部分。

④

DNA
连接酶只能封闭双螺旋

DNA
上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（

nick
）
,
而不

能封闭双链
DNA
的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（

gap
）。

⑤

由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，

DNA
连接酶在进行连

接反应时，还需要提供一种能源分子（

NADF
或
ATP

11.
大肠杆菌
DNA聚合酶和
Klenow
大片段各有什么作用？

DNA
聚合酶作用的特点：

要有底物
4
种
dNTP
为前体催化合成
DNA
接受模板指导。

需要有引物（

3
'
羟基）的存在。

不能起始合成新的

DNA
链。

催化
dNTP
加到生长中的

DNA
链
3
'
-OH
末端。

催化
DNA
的合成方向是
5
'
T
3'
。

Klenow
酶的基本性质：

大肠杆菌
DNA
聚合酶
I
经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的

氨基 酸残基片段
,
即
Klenow
酶。分子量为
76kDa
。< br>
Klenow
酶仍拥有
5
'
3
'
的
DNA
聚合酶活性和
5
'
去了

5
'
宀
3
'
的核酸外切酶活性。

Klenow
酶的基本用途：

C
末端
604
个

3
'
的核酸外切酶活性，但失

2 / 10


修复由限制性核酸内切酶造成的

之成为平头末端。

3
'
凹端，使

以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对

DNA

片段进行标记。

用于催化
cDNA
第二链的合成。

用于双脱氧末端终止法测定

DNA
的序列。

12.
T4-DNA
聚合酶

T4-DNA
聚合酶酶的基本特性：

有
3
'
宀
5
'
的核酸外切酶活性和
5
'
宀
3
'
的
DNA
聚合酶活性。

在无
dNTP
时，可以从任何

3
'
-OH
端外切。

在只有一种
dNTP
时，外切至互补核苷酸。

在四种
dNTP
均存在时，聚合活性占主导地位。

T4-DNA
聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的

3
'
粘性末端

13.
影响连接效率的因素有：

温度（最主要的因素）离子浓度

ATP
的浓度（
10
?
M - 1
）

连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）

反应时间（通常连接过夜）

插入片段和载体片段的摩尔比

DNA
末端性质

DNA
片段的大小

14.
如何将不同
DNA
分子末端进行连接？

1.
相同粘性末端的连接

如果外源
DNA
与载体
DNA
均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶

联合酶解，两种
DNA
分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺利的连接成一个重组

DNA

分子

2.
平头末端的连接

T4-DNA
连接 酶在
ATP
和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端

子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。

3.
不用粘性末端的连接

3
'
端的粘性末端用

T4-DNA
聚合酶切平

5
'
端的粘性末端用

klenow
酶补平，或者用

S1
核酸酶切平

最后用
T4-DNA
连接酶进行平末端连接

15.
碱性磷酸酶有什么作用？

1.
该酶用于载体

DNA
的
5
'
末端除磷操作，以提高重组效率；

2.
用于外源
DNA
片段的
5
'
端除磷，则可有 效防止外源

DNA
片段之间的连接。

16.
末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？

给载体或目的
DNA
加上互补的同聚物尾。

DNA
片段
3
'
末端的同位素标记。

17.
2
、细菌转化的步骤：

感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、

切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与

细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质

（如细菌溶素）的合成，

使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的

DNA
结合蛋白和核酸酶等。

转化因子的结合。受体菌细胞膜上的

DNA
结合蛋白可与转化因子的双链

DNA
吉构特

异性结合，单链

DNA
或

RNA
双链
RNA
以及
DNA/RNA
杂合双链都不能结合在膜上。

转化
因子的吸收。

双链

DNA
分子与结合蛋白作用后，

激活邻近的核酸酶，

一条链被

降解，而
另一条链则被吸收到受体菌中。

3 / 10

DNA
分


整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链

DNA
与另一种游离的蛋白因子结合，

形成整合
复合物前体结构，它能有效地保护单链

DNA
免受各种胞内核酸酶的降解，

并将其引导至受体菌染色体

DNA
处。

转化因子单链

DNA
的整合。供体单链

DNA
片段通过同源重组，置换受体染色体

的同源区域，形成异源杂合双链

DNA
结构。

18.
Ca2+
诱导转化原理：

①

在
0
C< br>的
Cacl2
低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时

Cacl2
使细胞膜磷脂层形成液

晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。

②

Ca2+
能与加入的
DNA
分子结合，形成抗

DNA
酶
(DNase)
的羟基
-
磷酸钙复合物，并黏附< br>
在细
菌细胞膜的外表面上。当
42
C
热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生

剧烈扰动，并
随之出现许多间隙，为

DNA
分子提供了进入细胞的通道。

③

Mg2+
对
DNA
分子有很大的稳定性作用，

因此利用
Mgcl2
与
Cacl2
共同处理大肠杆菌细

胞，可以提高

DNA
的转化效率。

但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。

19.
PEG
介导细菌的原生质体转化

PEG
是乙二醇的多聚物
，
存在不同分子量的多聚体
,
它可改变各类细胞的膜结构

，

使两细胞
相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组

,
此时相互接触的两

细胞的胞质沟通成为可能

，

从而造成细胞之间发生融合。

20.
电穿孔法

是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，

DNA
直接通

过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，

这种方法
称为电穿孔法。

P52
接合转化，入噬菌体感染未归纳

21.
转化率的影响因素

.
载体及重组
DNA
方面

载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其
转化率不同。

载体的 空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载
体。

插入片段大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。

重组
DNA
分子的浓度和纯度

受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配

转化操作的影响

22.
转化细胞的扩增

转化细胞的扩增操作：

指转化完成之后细胞的短时间培养。

在实验时，

扩增操作往往与转化

操作偶
联在一起，如：

Ca2+
诱导转化后的
37
C
培养一个小时

原生质体转化后的再生过程

入噬菌体转染后的
30
C
培< br>养等，均属扩增操作扩增操作的目的

增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程
序。

扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。

表达外源基因，便于筛选和鉴定。

23.
抗药性筛选法

这是利用载体

DNA
分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。

抗药性筛选法的基本原理：

抗药
性筛选法可区分转化子与非转化子、

重组子与非重组子将外

源
DNA
片段插在

EcoRI
位点：

非重组子呈

Apr
、

Tcr

重组子呈

Apr
、

Tcr
将外源
DNA
片段插在
BamHI
位点：

非重组子呈

Apr
、
Ter
重组子呈

Apr
、
Tes
抗药性筛选法的基本操作：

先将转化液涂布含有

Ap
的平板

再将
Ap
平板上的转化子影印至含有

Te
的平板上

在
Ap
平板上生长，但在

Te
平板上不长的转化子即为重组子

抗药性标记插入失活选择法

DNA

P56

经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非

重组子。
为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。如

果外源基因插入在
4 / 10