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基因工程原理复习题思考题
考试时间：
2009.06.21
上午
9
：
00-11
：
00
地点
5D305
基因工程绪论
1
、基因工程的定义与特征。
定义：
在体外把核酸分子
（
DNA
的分离、
合成）
插入载体分子，
构成遗传物质的新组合
（重
组
DNA
）
，
引入原先没有这类分子的受体细胞内，
稳定地复制表达繁殖，
培育符合人们需要
的新品种（品系）
，生产人类急需的药品、食 品、工业品等。
特征：
1
、具跨越天然物种屏障的能力。
2
、
强调了确定的
DNA
片段在新寄主细胞中的扩增。
2
、试述基因工程的主要研究内容。
1
）
、目的基因的分离
2
）
、
DNA
的体外重组（载体、受体系统等）
3
）
、重组
DNA
分子转移到受体细胞及其筛选
4
）
、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。
3
、基因工程在食品工业上有何应用发展？
主要是通过基因重组，
使各种转基因生物提高生产谷氨酸、
调味剂、
酒类和油类等有机物的
产率；或者改良这 些有机物组成成分，提高利用价值。
4
、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。
转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。
首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；
第二，延长食品保存时间或增加营养成分；
第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，
减少了农
药的使用量，有利于环境保护；
第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。
人们对转基因技术的 主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生
物，
产生新物种或超 级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样
性，也即转基因生物存在潜在的环境 安全问题。
转基因作物的大面积种植已有数年，
食用转基因食品的人群至 少有
10
亿之多，但至今
仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；
更何况目 前每一种基因工程食品在上市前，
都要
经过国家法律认可，
食品卫生部门和 环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市
场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基 因食品。
第一章
DNA
的分子特性与利用
1
、
原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？
1
）原核基因表达调控的三 个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控
原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。
2
）真核生物基因表达的特点：
?
1
．基因组
DNA
存在的形式与原核生物不同；
?
2
．真核生物中转录和翻译分开进行；
?
3
．基因表达具有细胞特异性或组织特异性；
?
4
．真核基因表达的调控在多个水平上进行：
DNA
水平的调控、转录水平调控、转
录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控；
1
2
、
什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？
基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，
是分子遗传的功能
单位。
根据基因的产物，基因可分为三类：
?
转录并翻译编码蛋白质的基因
:
包括结构蛋白基因、编码酶的基因、调节基因
?
转录但不翻译产物的基因
:
包括
tRNA
、
rRNA
?
不转录但有功能的
DNA
区段
:
如启动子、操纵基因
3
、
引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？
引起核酸变性的因素：
--
温度、酸、碱、甲醛和尿素等。
DNA
变性后，它的一系列性质发生变化，如紫外吸收
(260 nm)
值升高（增色效应）
,
粘度降
低等，如
DNA
增加
25
－
40%. RNA
约增加
1.1%
。
。
4
、
DNA
复性及其影响因素。
变性
DNA
在适当的条件下， 两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程
称为复性。
DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关，也与它本身的组成和结构有关：分子量越
大复性越难。浓 度越大，复性越容易。
（附加：
注意：
将热变性的
DNA
骤然冷却至低温时，
DNA
不可能复性。
但是将变性的
DNA
缓慢冷 却时，可以复性。
复性的应用：核酸的杂交，分子扩增）
第二章
基因工程操作的基本技术
1.
DNA
凝胶电泳中核酸分子分离的机理。
在碱性环境下，
核酸分子带负电荷，
在外加电场的作用下，
分子在凝胶多孔性 刚性滤孔
中从负极向正极泳动，
其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子 的目
的。
2.
DNA
凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？
1
）分子本身的影响
?
分子的大小：小则快
?
带电荷数：多则快
?
分子构型：超螺旋
>
解螺旋
2
）电场：直流电场
?
电压高则快
?
电压太高则结果不准确
常用
3~5V/CM
3
）支持物介质
?
种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
?
凝胶浓度
:
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
4
）电泳缓冲液
?
pH
值：偏碱性，带负电荷
?
离子浓度：离子浓度高
?
电流大
?
发热快
?
胶溶解
?
种类：
TAE
、
TBE
、
TPE
、TNE
2
3.
PCR
的原理和主要反应过程，并分析影响
PCR
扩增的影响因素。
PCR
原理：变性温度下，
DNA
双链变性双螺旋解开成单链DNA
，在退火温度中人工合成
的特异引物根据碱基互补配对原则与单链
DNA< br>特异结合，然后在
DNA
聚合酶的作用下，
在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照 碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板
DNA
互
补的新链，实现
DNA
的扩增。
影响
PCR
扩增的影响因素：
§
(1)Taq
酶：常用
1U/25?
L
?
浓度低，扩增产物不够；
?
浓度高，非特异性扩增增加；
?
酶的活性；
§
(2)dNTP
的浓度：常用
1 00-200?
mol/L
，不能低于
20?
mol/L
，特异性、 保真性；
§
(3)
模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有 酚、氯仿等杂质则难以成功。
使用量从几个
ng
到
100ng.
§
(4)
引物浓度：
0.1-0.5?
mol/L
之间，过多则非特异 扩增增加，形成引物二聚体；
§
(5)Mg2+
浓度：常用
0.5-2.5mmol/L
；
影响：酶的活性、引物
-
模板退火、特异性
§
(6)PCR
反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度
Tm
与时间、 引物延伸温度与时
间和循环数
4.
PCR
引物设计的原 则，若给一指定
DNA
序列并需要通过
PCR
扩增此序列，如何设计
扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了）
引物设计原则：
1
、
G+C
含量
45-55%
；
2
、
Tm
值高于
55
；
3
、引物特异性；
4
、引物扩增跨度；
5
、是否形成引物二聚体
5.
定量
PCR
的原理？
Ct
值的含义。
原理：通过 实时检测
PCR
每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行
定量及 定性的分析。
初始模板量
X0
的对数值与
C(T)
值之间呈线性关系：
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N
Ct
值的含义是 ：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值
时所经历的循环数（如后图所 示，图仅供参考）
阈值线
C(t) value
Ct
值
Threshold line
C(t) value
18.12
-
0.0
Ct
值
3
6.
分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链
DNA
的标记
方法是哪两种？
探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末端标记法，< br>PCR
标记法，体外转录标
记法。
探针按核酸分子分：
DNA
探针和
RNA
探针；
按标记物的不同：放射性标记探针和非放射性标记探针。
标记类型：按核酸分子的不 同：可分为
DNA
探针和
RNA
探针
根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针；
双链
DNA
探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法；
7.
Southern
杂交一般过程及影响杂交因素。
Southern
杂交操作步骤
:
(1)
用限制性内切酶酶切
DNA,
经凝胶电泳分离各酶切片段；
(2)
转膜：将
DNA
片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；
(3)
预杂交：封阻滤膜上非特异性位点；
(4)
杂交：让探针与同源
DNA
片段特异性结合；
(5)
洗脱：去除非特异性结合的探针；
(6)
自显影检查目的
DNA
所在的位置。
Southern
杂交影响因子
1
）
、目的
DN A
在总
DNA
中所占的比例
2
）
、探针的大小和标记效率
3
）
、转移到滤膜上的
DNA
量
4
）
、探针与靶
DNA
的同源性
8.
基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？
基因组文库的构建过程：
1
）从生物体提取大片断的基因组
DNA
；
2
）
用适当的限制性内切酶
（常为
4
碱基识别位点）
进行部分酶切或超声 波打断基因组
DNA
；
3
）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛 选适当长度的
DNA
片断（根据载体的要求）
；
4
）载体的酶切、回收；
5
）将处理好的基因组
DNA
片断与载体连接；
6
）将重组子导入宿主细胞
7
）文库的鉴定、收集、保存；
4
确定文库大小的方法：
以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质 量或完备性，
它与基因文库最
低所含克隆数
N
（即文库大小）之间的关系可用 下式表示：
N = ln ( 1
–
P ) / ln ( 1
–
f )
其中：
N
：文库所需的总克隆数；
P
：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率；
f
：克隆片段的平均大小
/
生物基因组的大小。
9.
基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？
10.
一般质粒
DNA
的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？
超螺旋质粒
DNA
、开环质粒
DNA
、线状质粒
DNA
在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：
超螺旋质粒
DNA>
线状质粒
DNA>
开环质粒
DNA
11.
碱裂解法提取质粒
DNA
的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。
碱裂解法原理：在碱性条件下，双连
DNA
氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充
分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌
DNA
不能复性呈不 溶物
而经离心除去。
（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写）
提取失败：
1
）洗去双链时，将质粒
DNA
洗去；
2
）破壁失败，质粒没析出；
3
）加剂问题
电泳失败：
1
）电压太高
2
）没加染色剂
3
）胶穿孔
4
）电泳时间过长
12.
电泳缓冲液使用一定时间后出现
DNA
在凝胶中跑不动现象 的原因，有何解决办法？
原因：电泳缓冲液的离子的富集作用；
解决方法：
1.
更换成新配置的电泳缓冲液；
2.
把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用
13.
电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？
指示剂一定要在电泳前加入， 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖
400
组成载样缓冲液；
（一
般为：溴酚兰 ，二甲苯青）
作用：①预知电泳的速率及方向；②使样品呈现颜色，便于加样；
< br>③一些高浓度蔗糖或其它物质增加
DNA
的密度，可以防止
DNA
的扩 散
染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；
（溴化已锭
[EB]
、硝酸银、
Goldview
染料）
作用：呈现出核酸电泳后的带型。
5
第三章
基因克隆的酶学基础
1
、
限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？（常用
II
型）
2
、
什么是星活性，产生星活性的因素可能有哪些？
在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种活性称星活性。
产 生
Star
活性的因素：
（书上
P46-P47
答案）
< br>高浓度甘油，碱性
pH
，存在
Mn2+
，低离子强度，低盐浓度，低< br>pH
3
、
结合已做的实验，分析影响酶切的因素。
（这个答案是上届的，仅供参考）
1
）
DNA
的纯度：
DNA
中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、< br>SDS
、
EDTA
等都会影响酶的
活性。
2
）
DNA
的甲基化程度
：
dam
甲基 化酶
（修饰
GA
TC
中的
A
）
；
dcm
甲基化酶
（修饰
CCA/TGG
的
C
）
。
3
）温度
：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是
37
o
C
，少数要求
40-65
o
C
。
4< br>）缓冲液
(Buffer)
：是影响限制酶活性的重要因素。
MgCl
2
、
NaCl/KCl
：
Tris-HCl
：
二硫苏糖醇（
DTT
）
：
β
－巯基乙醇：
提供
Mg
2+
和离子强度；
维持
pH
；
保持酶稳定性；
保持酶的稳定性，防止酶失活
牛血清白蛋白
BSA
等：
有助于酶的稳定；
4
、
限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。
（例子和图帮助大家理解而已）
< br>命名规则：
寄主菌属名的第
1
个字母＋种名的前两个字母＋菌株或菌型代号（大写）
＋空白
＋发现序列（罗马数字）
例子：
EcoRⅠ
(
E
：属名；
co
：种名；
R
：株；Ⅰ：发 现次序
)
6
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