细胞培养与病毒培养实验步骤

2021年2月27日发(作者：心绞痛的症状)
实验二

传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的

了解倒置显微镜的构造与使用，
了解不同传代细胞的形态及接 毒后的病变特征，
掌握细胞的传
代培养
方法
、病毒接种
方法
及收毒
方法
。

二、常用细胞的种类

BHK-21
：仓鼠肾传代细胞

PK-15
：猪肾传代细胞

IBRS-2
：猪肾传代细胞

Hela
：人的子宫瘤细胞

Vero
：非洲绿猴肾细胞

Marc-145
：来源于
Vero
细胞

TK-143
：人的胸苷激酶阴性细胞

Sf9
：昆虫细胞

三、材料

1
、
100ml
细胞瓶、吸管、吸球、
96
孔细胞培养板、加样器、枪头

2
、
BHK-21
（
baby hamster kidney
）细胞

3
、
0.25%
胰酶
4
、生长液：含
10%
犊牛血清、
200U/ml
青、链霉素的
DMEM

维持液：含
2-5%
犊牛血清、
200U/ ml
青、链霉素的
DMEM
5
、伪狂犬病病毒液（
PRV
）

四、传代细胞培养的条件要求

1
）细胞密度：
2-3
×
10
5
个
/ml
2
）
pH
范围

最适
pH7.0-7.4
，耐受
pH6.6-7.8
3
）培养温度


哺乳动物细胞一般为
37
℃


昆虫细胞
28-30
℃

五、常用细胞分散剂与作用原理

1
、胰酶

使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生 水解，导致细胞间质水
解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2
、乙 二胺四乙酸二钠（
EDTA
）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3
、灰色链丝菌酶

：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液

1
、人工综合营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2
、血清

1
）血清的种类


胎 牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以
新生犊牛血清 使用最为广泛。

2
）血清的处理

无菌采集，过滤除菌。用前
56
℃灭活
30min
。

3
）血清的作用

A
、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B
、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C
、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

D
、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。

E
、给培养液提供良好的缓冲系统。

F
、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。

4
）应用血清存在的问题

A
、血清中存在不少有害于细胞生长和繁 殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。

B
、血清的成分不明确，影响对结果的分析。

C
、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。

七、传代细胞系培养

1
、优点：
1)
可以无限的传代。

2)
不少细胞系对病毒很敏感。

3)
某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

4)
生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

2
、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。

3
、培养
方法

1
）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。

2
）加入
2ml
胰酶消化液，
于
37
℃培养箱放 置几分钟，
至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化
液。

3
）加 入生长液
,
反复吹打几次，
使细胞分散成单个细胞，
然后分装于
3< br>个小瓶中。再在每个小瓶中
补充生长液至
10ml
，然后置
37
℃培养箱培养，培养
1-2
天即可长成单层。

八、病毒（
PRV
）在传代细胞中的培养

1
、选长满单层的细胞，倒掉培养液。

2
、加入适量的病毒悬液

3
、置温箱中感作（吸附）
45min-1h
。

4
、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至
80%
以上的细胞 病变。

5
、收毒：将病变的细胞置于
-20
℃冰箱中，冻结后取出 自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细
胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器 中。低温贮藏备用。

实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）

一、实验目的


了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养
方法
。

二、材料

1
、
9-11
日龄鸡胚

2
、照蛋灯与蛋座

3
、碘酊棉球与酒精棉球

4
、大剪子、眼科剪、小镊子

5
、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、

6
、胰酶、生长液、维持液

三、细胞培养的条件要求

1
）细胞密度

原代细胞：
4-6
×
10
5
个
/ml
传代细胞：
2-3
×
10
5
个
/ml
2
）
pH
范围

最适
pH7.0-7.4
，耐受
pH6.6-7.8
3
）培养温度

哺乳动物细胞一般为
37
℃


昆虫细胞
28-30
℃

四、操作步骤
< br>1
、取
9-12
日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。

2
、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚 放
于灭菌平皿中。

3
、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用
DMEM
冲冼
2
次。

4
、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

5
、将剪 碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用
DMEM
充分冲洗，并静置几分钟，
待组织
块下沉，吸弃上层液体，再加
DMEM
。如此反复冲洗
2-3
遍。

6
、于沉淀组织块内加入约
4
倍量的
0.25%胰酶，并调
pH
至
7.6-7.8
，振荡混匀后置
37
℃水浴中感
作
30
分钟，每
10
分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全 （组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表
示消化足够）。

7
、取出，静置几分 钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用
DMEM
轻洗
2
次后，加入生长液
5 ml
，用大口径
吸管反复吹打，使细胞游离。

8
、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。

9
、细胞计数


取细胞悬液
0.5ml+2ml
0.1%
结晶紫—枸椽酸（
0.1mol/L
）溶液，室温或
37< br>℃温箱中
5-10min
，
充分振荡后进行计数。


按白细胞计数法计算
4
角
4
个大方格内的细胞总数（
N）。


每
ml
悬液中的细胞数（
n
）
=N/4
×
10000
×
K
（稀释倍数）。


活细胞数应在
90%
以上。

10
、将计 数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为
4-6
×
10
6
个/ml
，分层于细胞培养瓶中，每
瓶
1ml
，再补加
DMEM< br>生长液至
10ml
，盖上盖子，置于
37
℃恒温箱中培养。


五、结果的观察

○表示可计数

●
表
示
不
计