实验四 细菌接种培养法与生长现象观察

2021年2月27日发(作者：腿部皮肤过敏怎么办)
实验四


细菌的接种培养法与生长现象的观察

【目的和要求】

1
．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。

2
．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。

3
．熟悉细菌生长现象的观察方法。

【试剂与器材】

1
．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。

2
．培养基：固体、半固体、液体培养基。

3
．其他：温箱、酒精 灯、接种环、接种针、
L
形玻棒、打火机、记号笔等。

【实验内容】

一、细菌的接种工具

1
．接种环和接种针 ：其结构包括环（针）
、金属柄、绝缘柄三部分（见图
4-1
）
。其中
环
（针）
部分最佳材料为白金丝，
因其受热和散热速度快，
硬度适宜，不易生锈且经久耐用，
但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的
3 00~500W
电热镍铬丝。
一般要求接种环长
5~8cm
，直径为
2~4mm
，定量接种环的容量为
0.001ml
。

图
4-1

接种环和接种针



< br>接种环
（针）
在使用之前需检查镍铬丝是否呈直线，若有弯曲，
需用吸管或接种 环的另
一端将其压直；
若环不圆，
可将镍铬丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，
再 将镍铬丝突出的部分
朝内压紧。




接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。

2
．
L
形玻棒：由直径
2~3mm
的玻璃棒弯曲成
L
形制成。 在使用之前用厚纸包扎后置
高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布 接种。

二、细菌的接种方法

1
．液体培养基的接种



该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。

方法：
（图
4-2
）

（
1
）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。

（
2
）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧
灼 灭菌。

（
3
）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布 于培养基中。

（
4
）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。

（5
）在试管上做好标记，经
35
℃培养
18~24h
后观察结果 。

图
4-2

液体培养基接种法

2
．半固体培养基的接种

该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。

方法：
（图
4-3
）

（
1
）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

（
2
）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针
从 培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约
5mm
处（勿穿至管底）
，然后由原穿 刺
线退出，

（
3
）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。

（4
）在试管上做好标记，经
35
℃培养
18~24h
后观察结果 。

图
4-3

半固体培养基接种法

3
．平板划线接种法

该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定。

方法：

（
1
）连续划线法（图
4-4
）

1
）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

2
） 左手斜持平板，用手掌托着平板底部，五指固定平板边缘，在酒精灯旁以拇指、食
指和中指将平板盖撑开 大约
30~45°
角，
将已挑取细菌的接种环先在平板一侧边缘均匀涂布，
然 后运用腕力将接种环在平板上自上而下，来回划线。划线要密，
但不能重叠，充分利用平
板的面 积，不能划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染。

3
）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。

4
）在平板底上做好标记，经
35
℃培养
18~24h
后观察结果。

图
4-4

固体培养基连续划线法

（
2
）分区划线法（图
4-5
）

1
）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

2
） 同上法将平板盖打开约
30~45°
角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（
1
区）内作
来回划线，再在
2
、
3
、
4
区依次划线 ，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区
是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，< br>每区线间需保持一定距离，
线条要密而不重
复。

3
）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。

4
）在平板底上做好标记，经
35
℃培养
18~24h
后观察结果。

图
4-5

固体培养基分区划线法

4
．斜面培养基接
种法（图
4-6
）

斜面培养基主要用于细菌的纯培养，以进一步鉴定细菌或保存菌种。

（
1< br>）将接种环（或接种针）在火焰上烧灼灭菌，待冷却后以无菌操作挑取少许菌落。

（< br>2
）左手拿试管，打开试管塞后，试管口通过火焰灭菌，再将取有细菌的接种环由斜
面底 部向上划一直线，再由下至上在斜面上作曲线划线。

（
3
）试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。

（
4
）在试管上做好标记，经
35
℃培养
18~24h
后观察结果。

图
4-6
斜面培养基接种法

5
．涂布接种法

本法主要用于活菌计数和药敏试验。

（
1
）活菌计数：取一定稀释度的菌液
0.1ml
滴在平板上，用无菌
L
型玻璃棒将液滴涂
布均匀，盖上平板盖，经
35
℃培养
18~24 h
后计数菌落，则每毫升所含活菌数
=
菌落数
×
10×
稀释 倍数。

（
2
）直接涂布法：多用于纸片法和管碟法药敏试验。先配制一定浓 度的菌液，用无菌
棉签蘸取菌液后，在管壁上将多余的液体挤去，在
MH
琼脂平板上按 三个方向均匀涂布
3
次，最后沿平板边缘涂一周。盖上平板盖，置室温放置
5min< br>使平板表面稍干，然后用无菌
镊子将药敏纸片贴在培养基表面，
或向竖在平板表面的牛津 小杯内加入不同浓度的药物，
经
35
℃培养
18~24h
后观察结果 ，测定抑菌圈直径，按判断标准判定结果。

6
．倾注培养法

此法常用于标本或样品中活菌计数。

（
1
）方法：
1
）将标本用无菌生理盐水稀释成不同浓度：
10
-1
、
10< br>-2
、
10
-3
、
10
-4
、
10
-5
等。

2
）取不同稀释度的标本各
1ml
分别 注入直径
90mm
无菌平皿，迅速加入溶化并冷却至
约
50
℃的营养 琼脂
15ml
，轻轻转动平板使之充分混匀，待凝固后翻转平板。

3
）置
35
℃温箱孵育
18~24h
，计数菌落形成单位（
colo ny forming unit
，
CFU
）
，按下式
算出每
ml
标本中的细菌数：

1ml
标本中的活菌数
=
全平板
CFU
×稀释倍数

7
．细菌接种的注意事项