郑州精神病医院免疫组化的原理和步骤

2021年2月24日发(作者：额头皮肤粗糙)
免疫组织化学的概念：

免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂

(
荧光素、酶、
金属离子、同位素
)
显色来确定组织细胞内抗原< br>(
多肽和蛋白质
)
，对其进行定位、定性及
定量的研究，称为免疫组织 化学。


免疫组化实验所用的有哪些？

免疫组化实验中常用的 抗体为单抗体和多抗体。
单抗体是一个
B
淋巴细胞分泌的抗体，
应
用 细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从
动物血中所获得的 免疫血清，是多个
B
淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本和细胞标本 两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）
和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂 片。


其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好， 且能作连续
切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，
但可进行抗原修复，
是免疫组化中首选的组织标本制作方法。


石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？


石蜡 切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定
簇，同时蛋白之间发 生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行
IHC
染色时，需要先
进行抗原修复或暴 露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形
态。


常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复
液是
pH6.0
的
0.01 mol/L
的柠檬酸盐缓冲液。


免疫组化常用的染色方法有哪些？


根据标记物的不同分为免疫荧光法，免 疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对
某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种 方法敏感性更高，有利于微量抗原
(
抗体
)
在细胞或亚细胞水平的定位，其中 生物素
——
抗生物素染色法最常用。


抗体交叉反应的原因：


指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其 它抗原发生反应。
产生的原因有以下几
个方面：


1.
抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对
多种抗原分子特异性 的相应抗体。
任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗
原分子，必将与上述多特异 性的抗血清发生交叉反应。


2.
共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。


3.
决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一
决定簇的相应抗体可 以与大致相同的决定簇发生交叉反应。
当然抗原一抗体之间构象相似
时的结合力小于吻合时的结 合力。


免疫细胞化学技术


一、免疫细胞化学技术的概述

*
免疫细胞化学
(immunocytochemistry, ICC)

-
是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂

(
荧光素、酶、
金属离子、
同位素
)
显色来确定细胞内抗 原的成分
(
主要是多肽和蛋白质
)
，
对其进行定位、
定性及 定量的研究，称为～。


(
一
)
对抗原和抗体的要求

*
具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。


-
对抗体的要求：纯度高、比活性强；

*
高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。


-
对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。


(
二
)
抗原

(antigen, Ag)

*
抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和
(
或
)
细胞免 疫反应的物质，称为抗原。抗原
具有两个方面的特性：


-
免疫原 性：引起机体产生抗体和
(
或
)
致敏淋细胞的特性；


-
免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。


*
根据抗原是否显示免疫原性分为：


-
完全 抗原
：分子量较大，一般在
10kDa
以上，并具有较复杂的化学组成。

*
免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物
才具有良好的免疫原性。


-
半抗原
：又称为不完全抗原，分子 量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。

*
半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。


载

体

：通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能
力。


-
常用的载体有钥孔血蓝蛋白
(keyhole limpet hemocyanin
，
KLH)
、牛血清白蛋白
(bovine serum albumin, BSA)
、卵白蛋白
(Ovalbumin
，
OVA)
等。


-
用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团
-NH2
、-COOH
等将半抗原结合到载体
上。结合比例为
5kDa
结合
5
～
25
个分子的小肽。

（三）抗体

(antibody, Ab)

1
、抗体的概念：

*
机体受到抗原刺激后，
由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。


-
抗体主要存在于血清内；

-
抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。


-< br>免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既
IgG
、

IgD
、
IgE
、

IgA
、
IgM
。


2
、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。

*
单克隆抗体：是一个
B
淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物
制备的。


-
特异性强、抗体产量高。

*
多 克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多
个
B
淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

-
特异性低，会产生抗体的交叉反应。

-
多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。

< br>-
抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。


3
、抗体的制备
——
多克隆抗体的制备

*
动物的选择


*
佐剂
(adjuvant)

*
免疫方法


*
免疫剂量


*
抗体效价的测定


*
放血或定期抽血


(1)
动物的选择


选择什么动物来免疫取决于：


*
所需抗血清的量


-
小鼠只能提供
1.0
～
1.5ml
的血液，而 山羊能提供几升。


*
能供免疫用的抗原量


-
小鼠
50
?
g
足够，而山羊需要几毫克。

(1)
动物的选择
(
续
)

*
动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。


-
例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。


-
常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔
(
新西兰兔，年轻，健壮，体重在
2.5kg
左右，雄
性
)
为最常用。


(2)
佐剂

(adjuvant)

*
一般可溶性抗原注射后 ，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延
长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程 中，常将抗原和佐剂一起注射。


*
最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为
:

-
弗氏不完全佐剂
(Freund's incomplete adjuvant)

-
弗氏完全佐剂
(Freund's complete adjuvant)

弗氏不完全佐剂


(Freund's incomplete adjuvant, FIA)

*
是由油剂
(< br>石蜡油或植物油
)
与乳化剂
(
羊毛脂或
Tween80)混合而成，
比例为
1:1
、
2:1
、
3:1
或
5:1
，可根据需要而定，通常
2:1
。

*
使 用时与水溶性抗原按
1:1
比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。

弗氏完全佐剂

(Freund's complete adjuvant, FCA)

*
在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌
(终浓度为
2
～
20mg/ml)
，
即成
为
FC A
。

*
免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积

1:1
混合乳化后
(
油包水
)
注入动物。


-
一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。


佐剂与抗原乳化的方法


*
研磨法：适于制备大量的佐剂抗原


-
先将不完全佐剂 加热，取
1.73ml
放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入
0.23ml
活卡介苗 ，
边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。


-
按同样方法滴人 抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部
加人后，应成为乳白色粘稠的油包 水乳剂。


*
缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。


佐剂与抗原乳化的方法
(
续
)

*
注射器混合法


-
将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两 个
5ml
注射器内，然后插入三通管内，交替推动针
管混匀，往复操作直至形成粘稠的 乳剂为止。


*
优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。


*
缺点：不易乳化，时间长。


佐剂与抗原乳化的方法
(
续
)

*
快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。


-
将抗原和佐剂按所需量加入一中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下

0.5cm
，离
瓶底
0.5cm
左右，以免打碎。


-
每次乳化

10
～
15s
，然后置冰 箱
lmin
左右。反复乳化
3
～
4
次即可完全乳化。管内残
余量
800r/min
离心
5
～
10min
收集。


*
优点：简单、快速、节省材料。


乳化剂的鉴定


*
判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在 水面上
(
冷水中
)
，如能长时间保持圆珠
形而不散开，表示乳化达到 要求。


(3)
免疫方法
——
免疫途径


*
常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。


*
一般采用多点注射方法


-
常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。


-
皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。


(3)
免疫方法
——
免疫途径

(
续
)

*
几点说明：


-
大动物一般不用腹腔注射

-
颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射

-
抗原宝贵可采用淋巴结 内微量注射法，只需
10
～
100
?
g
抗原即可获得较好的 免疫效果。

-
皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。

(3)
免疫方法
——
次数及间隔时间


*次数一般为
2
～
3
次
(
初次免疫和加强免疫
)

-
首次注射后，
10
～
15
天再加强注射；

-
剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。


*
间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长


-
豚鼠、 大鼠为
7
～
8
天，兔子为
10
～
15
天， 羊为
14
～
28
天；

-
第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。

举例
1
：家兔的免疫

*
初次免疫


-
用
50
～
200
?
g Ag
加入
FCA
，在背部皮下注射
6
～
8
点，每点
0.1
～
0.2ml
，也可肌肉
内或皮内注射；


*
两周后，加强免疫


-
将
50
～
200
?
g Ag
于
PBS
或
FIA
中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；

*
抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血


-
抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在
1:4000
以上，后者在
1:16
以上，即可采血，取血清进一步提纯。

举例
2
：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔


*
一般选择
2.5
～
3.0kg
的新西兰种公兔

-
先在其两脚垫注射完全福氏佐剂
0.2ml(
卡介苗每兔合
5mg )
；


-10
天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的 淋巴结内，第一次注射抗原用完
全福氏佐剂混合乳化；


-
以后每 隔
20
天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强
2
次，各次注射的抗原 均
为
25
～
50
?
g
；

-
末次注射两周后兔耳放血测价

(
可达
1:128)
。


举例
3
：豚鼠和大鼠的免疫

*
初次免疫


-
用
10
～
100
?
g
Ag
加入
FCA
，在背部皮内注射
4
～
6
点，每点

，也可肌肉内或皮
下注射；


*
加强免疫


-
每隔

7
～
8
天，将
10
～
50
?
g Ag
于

PBS
或
FIA
中。在肌肉、皮下或静脉注射；

*
抗体效价的检测


(4)
免疫剂量


*
抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；


*
免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。


(4)
免疫剂量

(
续
)

*
各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量


(5)
抗体效价的检测


多采免疫双向扩散法


【基本原理】


*
指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。


-
将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，
使两者进行相互扩 散，
当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。


*
优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。


免疫双向扩散法的操作步骤


*
将玻璃板用水洗净后用
7 5
％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。

*
将
1
％
agar
融化后，置
56
℃水浴。

*
在玻璃板上铺胶，约
1.5mm
厚，凝固后打孔
(
直径

3rnm)
，孔间距
10mm
。


*
中心孔加
5
?
l
抗原样品，
周围孔内每孔加
5
?
l
抗血清
(
抗体预先作系列倍比稀释即

1:2
、
1 :4
、
1:8
、
1:16
、
1:32
等比例
)
。


*
凝胶板置湿盒内，室温扩散
24h
。

*
观察结果。


抗体效价检测的其它方法