芦荟去痘痘胶内酶解

2021年2月23日发(作者：昆明做人流)
一、

试剂准备

1
．
30mmol/L K
3
Fe(CN)
6

铁氰化钾

9.9 mg K
3
Fe(CN)
6
溶于
1mL Milli-Q
水


2
．
100mmol/L Na
2
S
2
O
3

硫代硫酸钠


24.8 mg Na
2
S
2
O
3
溶于
1mL Milli-Q
水


3
．
200mmol/L NH
4
HCO
3

碳酸氢铵


0.079g NH
4
HCO
3
溶于
5 mL Milli-Q
水


4.
覆盖液

（酶解缓冲液）


40mmol/L NH
4
HCO
3
, 10% ACN

200ul 200mmol/L NH
4
HCO
3
, 100ul ACN, 700ul Milli-Q
水


5.
萃取液


50
％

ACN
，
0.1% TFA

6.
胰蛋白酶

贮存液：胰蛋白酶溶于
50mM
醋酸溶液中（
1mL Milli-Q
水加入冰醋酸
2.86 uL
），浓度
1ug/uL
，即每管
20ug
，溶于
20uL 50mM
醋酸溶液中。


工作液：使用覆盖液稀释至
10ng/uL

7.
脱色液


银染脱色液：
30mmol/L K
3
Fe(CN)
6
与
100mmol/L Na
2
S
2
O
3
1:1
混合


考染脱色液：
50
％

ACN, 40mmol/L NH
4
HCO
3



以上试剂单 独存放在质谱准备室，
不要使用其他来源的药品、
试剂，
其中脱色液需现用现配。

二、

实验步骤

1.
切胶

用剪刀剪断
Tip
（进口
Tip
），将蛋白 质斑点从凝胶上切下，置于
0.5 mL EP
管内（进口产
品），每管加
Milli-Q
水
400 uL
振荡洗涤
2min
，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。


2.
脱色

银染样品：每管加入现配脱色液
50-80uL
（视胶粒大小而定），静置
2min
左右，当胶粒由
棕黑色 变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入
400uL Milli-Q
水终止反应，重新加
入
400uL Milli-Q
水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。

（
3
％
H
2
O
2
/25mM NH
4
HCO
3
/H
2
O
）

考 染样品：每管加入现配脱色液
50-80uL
（视胶粒大小而定），静置
2min左右，待胶粒蓝
色褪却时，加入
400uL Milli-Q
水终止反应，重新加入
400uL Milli-Q
水振荡洗涤一次，吸出
多余的液体。

3.
洗涤

向每管加入
200uL 40mmol/L NH
4
HCO
3
，振荡洗涤
2min
，多余液体吸出丢弃，重复
1
次。



4.
脱水

向每管中加入
100-150 uL
纯
ACN
，振荡脱水，待胶粒 变白后，将
CAN
吸出舍弃，将装有
胶粒的离心管开盖置于真空干燥箱或真空浓缩仪中 干燥处理
10min
。



5.
酶解


a)
根据胶粒大小，加入合适体积的胰蛋 白酶工作液（浓度
10ng/uL
），以完全盖住胶
粒为准，冰浴
45min
，使胶粒充分吸收酶解液并溶涨。

b)
将管内多余的酶解液吸出舍弃，加 入
20-40uL
覆盖液（以完全盖住胶粒为准），倒置放
在
37
度 烘箱中孵育过夜（
12-16
小时）。



6.
肽段抽提


次日，吸出管内酶解溶液，置于另一
0.5 ML EP
管中，在装胶粒的原
EP
管中加入萃取
液
20uL,
振荡洗涤
20min
，
吸取液体与第一次吸取的液体合并，
再次加入萃取液< br>20uL,
振荡
洗涤
10min
，并超声
5min
，吸取液体与前两次合并。



7.
离心


将新管内三次萃取的液体于离心机内
10000rpm
离心
5min
，吸取上层溶液转移至新的
EP
管内，注意不要吸取底部可能存在的 微小胶粒沉淀。



8.
真空干燥


将装有抽提液的离心管开口置于真空干燥机内浓缩抽干，约需
3h< br>左右，再加入
0.1%
的
TFA
水溶液复溶，置于－
20度冻存待用于质谱鉴定。

三、

注意事项