丰胸瘦身转铁蛋白与RGD共修饰脂质体用于脑胶质瘤靶向性研究

2021年2月22日发(作者：淋巴细胞百分比偏低的原因)
修改要求
:
1
）

请补充通信作者、通信作者办公室

电话和电子邮箱。


通讯作者就是第一作者
,
重复删除通讯作者

2
）请下载附件，在附件基础上修改



已经修改

3
）
请在
“
作者修改说明
”< br>处，逐一回答对以下问题是如何修改的。



已经修改

修改意见
:
1.

本文中制备
“RGD
修饰脂质 体
”
、
“
转铁蛋白修饰脂质体
”
是如何鉴定的？文章仅说明 共修
饰脂质体的电镜鉴定，前两者的大小数据是如何得来的？文章未介绍清楚，如果是别
人的试 验结果建议删除。

本研究制备得到的
RGD-LP
和
TF-LP< br>也是通过马尔文激光粒度仪测定得到的粒径和电位，
投
射电镜只是作为脂质体的表征观察 ，对于测定粒径等参数不如马尔文粒度仪精确。因此文
中只附上了共修饰脂质体的投射电镜图。


2.
本文所用电镜的型号、产地是什么？

本研究用到的投射电 镜型号已经在文章中添加，并用红色标记。
H-600IV
型透射电子显微镜
(Hit achi, Japan)

3.
全文图表及参考文献请按本刊格式修改、补充。

关于参考文献和图表已经按照要求进行了修改。









转铁蛋白与
RGD
共修饰脂质体用于脑胶质瘤靶向性研究

邵云，俞向荣，吴一平，姚建社，羊正祥

(214023
江苏无锡
,
无锡市人民医院神经外科
)

[
摘要
]
目的：
构建转铁蛋白与整合素受体
RGD
共修饰脂质体并对其脑胶质瘤靶
向性进行初步研究。
方法：
采用薄膜分散法制备RGD
修饰脂质体，
采用后插入法
制备转铁蛋白与
RGD
共修饰 脂质体，观察其形态，粒径，电位。并通过
U87
脑胶
质瘤细胞摄取实验以及裸鼠脑组 织离体成像实验考察脂质体的脑胶质瘤靶向性。
结果：
所制备的双配体脂质体粒径在
R GD/TF-LP (120
±
8.5) nm
，电位为（
-5
±
1.15
）
mV
。体外细 胞摄取实验表明，
U87
脑胶质瘤细胞对共修饰脂质体的摄取
效率分别是转铁蛋白修饰 脂质体和
RGD
修饰脂质体的
2.1
倍和
2.7
倍。
肿瘤球摄
取实验以及裸鼠脑组织离体成像实验表明共修饰脂质体具有良好的肿瘤靶向性
以及脑 部肿瘤传递能力。
结论：
转铁蛋白与
RGD
共修饰脂质体具有一定的脑胶质< br>瘤靶向性，是一种潜在的脑胶质瘤给药系统。

[
关键词
]

转铁蛋白；
RGD
；脂质体；脑胶质瘤


Transferrin and RGD co-modified liposome for glioma targeting
SHAO Yun,YU Xiang-rong,WU Yi- ping,YAO Jian-she,YANG Zheng-xiang
(Department of Neurosurgery , Wuxi People's Hospital , Wuxi 214023 ,China)

Abstract

Objective:
To prepare transferrin and RGD co-modified
liposome and evaluate their glioma targeting
efficiency
in vitro and in
vivo
．
Methods:
The co-modified liposome was prepared by
film-ultrasonic method. The appearance
，
particle size
，
Zeta potential were
evaluated. The cellular uptake by U87 cells in vitro and vivo imaging
were used to evaluate the targeting efficiency.
Results:
The particle
diameter of the co-modified liposome was
（
120±
8.5
）
nm with the Zeta
potential of
（
-5±
1.15
）
mV. The result demonstrated that the co-modified
liposome uptaken by U87 were 2.1, 2.7 times higher than that of
transferrin modified liposome and RGD modified liposome, respectively.

The evaluation of tumor spheroid penetration and in vivo imaging show
the co-modified liposome has the strongest fluorescence intensity.

Conclusion:
The co-modified liposome might serve as a promising
glioma delivery system of antitumor drugs.
Key words
: Transferrin;
RGD; Liposome;
Glioma

原发性中枢神经系统肿瘤的发病率不断增加，
其中，
神经胶质瘤占总发病数
的
77%
～
80%
左 右，是颅内最常见的恶性肿瘤
[1]
。手术治疗是脑胶质瘤临床治疗
的首选方案。然而由于脑胶质瘤本身是侵润生长，
不易与正常的脑组织区分，
因
此在手术过程中 很难将肿瘤组织全部切除，
为了杀伤肿瘤细胞还需要放射治疗和
化疗。
然而化疗药物很 难到达脑部肿瘤组织还会产生很大的副作用。
因此脑胶质
瘤的治疗迫切需要新手段。

转铁蛋白受体是一种在正常细胞和肿瘤细胞表面都普遍存在的受体，
但是在
肿瘤细胞的 表面（尤其是脑胶质瘤）转铁蛋白受体的表达是正常细胞的
4
～
5
倍
[2]
。整合素（
Integrins
）是一类细胞黏附受体分子，在有核细胞表面均 广泛表
达，其中整合素
α
v
β
3
在神经胶质瘤、黑色素瘤、 卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤
相关的内皮细胞表面高度表达，
与肿瘤的血管发生，
肿瘤 转移及肿瘤的抗放射治
疗密切相关，
因此整合素
α
v
β
3< br>常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。
已有研究表明，
精氨酸
-
甘氨酸-
天冬氨酸（
Arg-Gly-Asp,
RGD
）的三肽序列能够特异 性地识别含
α
v
亚基的整合素家族，具有高度亲和力
[3]
。脂质体 是由磷脂组成的具有双层
膜结构的球形结构。
能够在水相包载亲水性的药物，
也能在脂 质双层包载亲脂性
的药物同时，
脂质体可以很容易进行表面修饰，
可以引入
P EG
延长循环时间，
达
到长循环的效果，也可以连接配体成为主动靶向脂质体。

本研究成功制备了转铁蛋白
（
TF
）
与
RGD
共修饰的脂质体，
并对共修饰脂质
体的靶向性进行了体内外评价。

1
材料与方法

1.1

材料

1.1.1
主要试剂与仪器

H-600IV
型透射电子显微镜
(Hitachi, Japan)
；
Sizer Nano ZS90
型激光粒
度仪及
ZETA
电位分析仪
（英国
Malvern
instruments
Ltd
）
。
RGD
peptide
(
成
都凯捷生物公司
)
；
大豆磷脂
（
SPC
，
上海太 伟药业有限公司）
；
DSPE-PEG2000
（美国
Avanti
polar
lipids
公司）
；胆固醇（
Cho
，美国
sigma
公司）
；
DMEM
高糖培养基
（美国
G IBCO
公司）
；
转铁蛋白
（美国
sigma
公司）
；
香豆素
-6
（美
国
sigma
公司）
；
DSPE-PEG2000-MAL
(
美国
sigma
公司
)< br>；
其余试剂为分析纯。
人脑胶质瘤细胞
(U87,
上海细胞研究所)
。

1.2

方法

1.2.1

RGD
修饰脂质体的制备

参照文献
[4]
方法合成
DEPE-PEG2000-RGD
。使用薄膜分散法制备
RGD
修饰脂
质体。将处方量的香豆素
-6
，
SPC
，
Cho
，
DSPE- PEG2000-RGD
，
DSPE-PEG- OMe
（保
证总磷脂：胆固醇
=70:30
（
molar rati o
）
，分别溶于氯仿，置
50ml
茄形瓶中旋
转蒸发成膜后，再置真 空干燥器中过夜。加入
2.5 mL PBS
缓冲液（
pH7.4
）
，置
空气浴摇床中，
37
℃，
180rpm
，
20min< br>水化，水浴超声
5min
脱膜，探头超声
(80
W
×
5 s
×
15
次
)
制备得到
RGD
修饰的脂质体（
RGD-LP
）
。

1.2.2

转铁蛋白修饰脂质体的制备

转铁蛋白修饰脂质体（
TF-LP
）分五步进行。第一步是采用同于“
1.2 .1
”的
方法制备普通脂质体。

第二步：精密称取适量转铁蛋白，用巯基化反应液溶解并使其浓度为
12
mg
·
ml
-1
，精密称取适量
Traut’s
reagent
同样以巯基化反应液溶解并使其浓度
为
2 mg
·
ml-
。将二者混合并使
TF
：Traut’s reage nt=1:5（摩尔比）
，在微型
振荡器中避光反应
125rpm
，
25
℃，
1h
，得到巯基化的转铁蛋白（
TF- SH
）
。将反
应后得到的
TF-SH
溶液过
G50
葡聚糖凝胶柱（
1
×
20cm
）分离
TF- SH
和游离的
Traut’s reagent。

第三步：精密称取一定量
Mal-
DSPE-PEG2000
溶于氯仿中， 在茄形瓶中减压
蒸馏成膜，除去有机溶剂，置于真空干燥器中过夜，使其充分干燥，加入适量
1
PBS
水化，制备
Mal-DSPE-PEG2000
胶束。

第四步：将第二步制备好的
TF-SH
与第三步制备好的
Mal- DSPE-PEG2000
胶束按照一定比例混合（
TF-SH
：
Mal- DSPE-PEG2000=1:10
，摩尔比）在微型振
荡器中避光反应
125rpm
，
25
℃，
4h
，使
TF- SH
中的
-SH
与
Mal- DSPE-PEG2000
中的
Mal
相结合，
反应完后加入适量
10mg
·
ml-1
的
2-MEA
溶液
（并使溶液中
2-MEA
最终浓度为
1mM
）
，
继续反应
30min
，
使
2-MEA
上
-SH
与
TF- SH
上
-SH
竞争性结合
Mal- DSPE- PEG2000
上的
Mal
，以反应掉剩余
Mal-DSPE- PEG2000
。最终得到
TF-Mal-PEG2000
胶束。

第五步：将第一步制备的普通脂质体与第四步得到的
TF-Mal-PEG2000
胶 束
按照脂质材料：
胶束
=50:1
（
摩尔比）
比例混合后，
微型振荡器中避光反应
150rpm
，
37
℃
，
1h
。
反
应
后
溶
液
过
CL-4B
琼
脂
糖
凝
胶
柱
（
1
×
20cm< br>）
除
去
游
离
的
TF-Mal- PEG2000
胶束，得到转铁蛋白修饰的长循环脂质体。

1.2.3

转铁蛋白与
RGD
共修饰脂质体的制备

取
“
1. 2.1
”
项
制
备
的
RGD
修
饰
脂
质
体
与
“
1.2.2
”
项
第
四< br>步
制
备
的
TF-Mal-PEG2000
胶束按照“
1.2.2
”项第五步方法制备得到
TF
与
RGD
共修饰的
脂质体（
RGD/TF-LP
）。

1.2.4

共修饰脂质体的形态，粒径和
Zeta
电位

将共修饰的脂质体用磷 钨酸染色，
采用透射电镜
（
TEM
）
观察形态。
取适量RGD/TF-LP
、
TF-LP
和
RGD -LP
样品用马尔文激光粒
度仪测定其粒径以及电位。

1.2.5

不同脂质体体外细胞摄取实验

将
U87
细胞按每孔
1×
10
5
个细胞接种于含
10%
血清
24
孔板 中，
培养
24
h
后，
在孔板中加入样品
RGD- LP,TF-LP
和
RGD/TF-LP
，每个孔加入
100
μ< br>L
，于
CO
2
培
养箱中分别孵育
2
h，
弃去培养基，
加入适量
PBS
清洗
3
次，
加 入
1
mL1%triton-100
裂解细胞，
4
℃避光裂解
0.5 h
以上，待裂解完全后，取各组样品各
200
μ
L
在
Ex=465 nm
、
Em=502 nm
用荧光分光光度计测定的荧光强度。

1.2.6

U87
脑胶质瘤细胞体外肿瘤球模型的构建以及对脂质体的摄取考察

取对数 生长期的
U87
细胞用
0.125%
胰酶消化后，用含血清的培养基中和胰< br>酶，
并将细胞吹打下来后离心，
弃去上清液用培养基重悬细胞后接种于用低熔点
琼脂糖预处理的
96
孔板中，
将
96
孔板移入
37
℃
CO
2
孵箱中培养。
肿瘤球生长
7
天后，
分别 加入载香豆素
-6
的
RGD-LP,TF-LP
和
RGD/TF- LP
，
加培养基调整脂质体的
终浓度为

-1
。
37
℃孵育
4h
后，将细胞用
PBS
漂洗三次，加
4%
多聚甲
醛固定
15min
，弃去多聚甲醛，用冰
PBS
保存。置激光 共聚焦荧光倒置显微镜观
察肿瘤球摄取情况。

1.2.7

裸鼠荷
U87
胶质瘤模型的建立以及裸鼠脑组织离体成像

U87< br>细胞经胰酶消化，
离心后将其悬浮于
DMEM
培养液中，
计数调节浓度 至
5
×
10
7
个
/ml
。
3
只裸 鼠（约
25g
，雌性）
i.p.0.4g/kg
水合氯醛麻醉，内毗连线与头部矢状中线交汇处纵向
1cm
长头皮切口，分离暴露颅骨，于前囱旁开
3mm
，
向后
1mm
处颅骨钻孔。
微量注射器吸入
10
μ
l
上述细胞悬液，
固定于立体定位仪
上，
沿钻孔垂直进针深
6mm(
右侧大脑纹状体区
)
，
后退
1mm
注射
U 87
细胞悬液
10
μ
l
，留针
5min
，缓慢拔针 ，以生理盐水冲洗，切口用线缝合打结。

按照“
1.2.1
”、
“
1.2.2
”和“
1.2.3
”项下方法制备载近红外荧光染料
DI R
的不同脂质体，荷瘤裸鼠尾静脉注射
4 h
后，
，将小鼠用
10%
水合氯醛麻醉，仰
卧固定，经心脏灌流生理盐水及多聚甲醛后，取脑组织于荧光活体成像系统下 观察
并拍照
(Ex=730
，
Em=790)
。

1.3

统计学方法

实验数据以均数±标准差表示，
SP SS11.0
统计软件进行数据分析，
两组
间比较用
t
检验，多组间 比较用方差分析。
P<0.05
表示差异有统计学意义。


2

结果

2.1

不同脂质体的表征

共修饰脂质体的透射电镜扫描如图
1
所示，制备的脂质体成球状，形态
均一。
采用马尔文激光粒度仪测得各组脂质体的
粒径与电位结果如表
1
所示，
不同脂质体的的粒径均小于
200 nm
，
PDI
小于
0.3
，符合实验要求。