使用RNAscope 技术探索 HBV DNA, cccDNA以及mRNA 在肝组织中的分布

2021年2月19日发(作者：老人头晕是怎么回事)
使用
RNAscope
技术探索

HBV DNA
，

cccDNA
以及
mRNA
在肝组织中的分布


简介

HBV
的感染侵入病人体内细胞后，
其内含的
HBV-DNA
脱离包 裹的蛋白质被释放形成
rcDNA
，
依赖宿主的
DNA
聚合酶补齐形 成更加稳定的
cccDNA
，并以
cccDNA
作为模板转录出不同
大小的
mRNA
，作为各种抗原蛋白以及
HBV-DNA
的逆转录模板。基于 各类核酸不同但同
样重要的作用，本项目旨在用一种新型的
RNAISH
技术
RNAscope
@
来标定
HBV-DNA
，
cccDNA
，
mRNA
，探索各类核酸在乙肝病人组织中的差异分布，并比较在乙肝病人四个发
展 阶段（
immunotolerant, immune active, inactive carrier, and HBeAg-negative hepatitis
）
的不同变 化，以及
INF
治疗效果不同病人之间的差异变化。本项目有助于我们进一步了解
HB V
传播的机制，为
HBV
的治疗提供指导。


背景

HBVcccDNA
的形成

HBV
侵入人的肝细胞

,
在细胞质中脱去核壳

,
形成

rcDNA
。
rcDNA
进入肝细胞核中 解脱正
链
3
′端连接的末端蛋白、负链

5′端的

RNA
残段（图一）

;
依赖宿主细胞的

DNA
聚合酶
补齐两条链上的缺口

,
并进一步折叠、
扭曲形成超螺旋结构的

cccDNA ,
并以
cccDNA
为模
板转录为不同大小的

mRNA ( 3.5Kb
、

2.4Kb
、
2.1Kb
、
0.8Kb mRNA) ,
从而翻译各种病毒
蛋白。其中

3,5 Kb
的
pgRNA
作为逆转录模板

,
利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负
链

DNA
,
再以负链

DNA
作为模板

,
通过病毒

DNA
聚合酶的作用

,
合成正链

DNA
,
与
负链

DNA
一起组成新的
HBV rcDNA
。新合成的

HBV rcDNA
一方面进入细胞核内

,
转化
为新的

cccDNA
,
补充细胞内的

cccD2
NA
库

,
使每个肝细胞中保持大约

5
～
50
个
cccDNA
分子

;
另一方面与病毒蛋白装配成新的完整

HBV ,
释放至细胞外

,
再感染健康的肝
细胞

(
见图

1) [1]
。

In
HBV
genome,
the
incomplete
plus
strand
has
avariable
3
‘
-end
but
a
defined
5
’
-end
around
position
1600near DR2, while the complete minus
strand
has
defined5
‘
- and
3
’
-ends with a
terminal redundancy of 9 bases
[27].There is a
gap
around position
1800
near DR1 (Fig. 1).

图一
HBV
基因组结构。
HBV
基因组有部分单链，部分双链，以及部分的三
DNA
链在病毒
粒子中。
各
HBV
正义链的长度会有很大的 不同，
但是负义链有固定的
5
‘

-
和
3
’

-
端靠近
1800
左 右的位置。圆圈，引物酶；钻石圈，
DNA
聚合酶。


2.
传统
HBVcccDNA
的常用检测方法

根据
cccDNA
与
rcDNA
在结构和理化特性上的不同

,
可以建立检测

cccDNA
的方法

:
(1)
rcDNA
能与蛋白质共价结合

,cccDNA
则不能。
(2) rcDNA
的双链是不对称的

,
全长的一链
与病毒

mRNA
互补

,
为负链

,
较短的一链为正链。
在正链和负链上均存在缺口

,
两链

DNA
通过

5′端

250
～
300
个互补碱基的氢键作用形成部分环状结构

,
而非超螺旋结构

;
cccDNA
的两条链均是完整的

,
形成超螺旋结构。
(3)
由于正链和负链上均有缺口存
在

,rcDNA
可以被一些能够切除单链或含有缺口

DNA
的核酸酶如
Plasmid2Safe
TM
A
TP2dependent DNase
、
绿豆核酸酶
(mung bean nuclease)
等降解成寡核苷酸或单核苷酸

,
而

cccDNA
则由于双链结构完整

,
不会被上述酶降解
[2,3]
。

(
一
) Southern blot
HBV
cccDNA
以往多用

Southern
blot
方法进行检测

,
该方法是分子生物学的经典方法

,
但对操作者的技术要求较高

,
且步骤繁琐

,
灵敏度较低
[4]
。


图二

Primer selection. PCR was performed to select primer pairs which can speci
?
cally
amplify
DNA
fragment
from
HBV
cccDNA
but
not
genomic
DNA
in
the
PCR.
The
10
6

copies of cccDNA from a plasmid containing HBV genome were used as template in lane
1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, and 15; while 1.6
×
10
6
copies of virus DNA isolated from HepAD38
condition medium were used as template in lane 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16,17, and18. Primer
pairs:
1,
4,
HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R1;
2,
5,
HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R2;
3,
6,
HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R3;
7,
10,
HBV
CCC
F2/HBV_CCC_R1;
8,
11,
HBV
CCC
F2=HBV_CCC_R2; 9, 12, HBV CCC F2=HBV CCC R3; 13, 16, HBV CCC F3=HBV CCC
R1; 14, 17, HBV CCC F3= HBV CCC R2; 15, 18, HBV CCC F3=HBV CCC R3.
HBV_CCC_F1: 5
’
-ACTCTTGGACTCBCAGCAATG-3
’
;

HBV_CCC_F2: 5
’
-TGTTCACCAGCACCATGC-3
’
;

HBV_CCC_F3: 5
’
-GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-3
’
;

HBV_CCC_R1: 5’
-CTTTATACGGGTCAATGTCCA-
3’;

HBV_CCC_R2: 5
’
-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3
’
;

HBV_CCC_R3: 5
’
-GTCCATGCCCCAAAGCCACC-3
’
.

(
二
)
普通

PCR
基于
rcDNA
的正链和负链上均存在缺口

,
故可以设计跨越两个缺口的引物

,
使

rcDNA
不
被扩增

, cccDNA
由于有完整的双链可以被有选择地扩增
[2,3]
。


(
三
) Real-TimequantitativePCR
He
等
[3]
建立了实时荧光定量检测
cccDNA
的方法。他们将 具有发光基团和淬灭集团的
TaqMan
探针设计于负链缺口的下游

,
与负链互补。
在上游引物的引导下

,
若负链是完整的

,
Taq
酶则到达

Taq2
Man
探针所结合的位点

,
利用其

5′→3′的外切酶活性将探针切断

,
从
而

3′端的淬灭集团失去对

5′端发光集团的抑制作用

,
产生荧光信号。若负链含有缺口

,
由
于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口

,
故不能产生荧光信号。这样

,cccDNA
和

rcDNA
得以区分开来。此方法变普通

PCR
法的终点监测为实时动态检测

,
不需对

PCR
反应产物进行开盖检测

,
从而减少了

PCR
产物污染的可能

(
见图

3)
。


图

三

RT- qRCR
检测
cccDNA
（四）入侵检查（
Invader Assay
）

入侵检查是近年来刚开始应用的技术。其基本原理是目标
DNA
设计一对探针

,
一个探针称
为初始探针

(primary probe) ,
另一个称为入侵探针
(invader probe) ,
初始探针的

5′端一段寡
核苷酸序列不与目标

DNA
互补

,
入侵探针

3′末端的单个碱基不与目标
DNA
互补，< br>Flap
核酸内切酶
I
（
FlapendonucleaseI
）将初始探针
5
‘端不与目标
DNA
互补的寡核苷酸序列剪
切下来 ，之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的

FRET
(
Fluorescence
Resonance Energy Transfer)
探针相结合

,
从而产生荧光信号

,
能够被实时荧光

PCR
仪
器检测

[5]
。

D KH W
等
[6]
根据此原理

,
分别设计了与

HBV DR2
区正链下游、负链上游
相结合的两种入侵探针

,
这样当正链、负链均为完整时产生两种荧光信号

,
从而检测

cccDNA
;rcDNA
由于正链含有缺口

,
只能产生一种荧光信号

,
得以和

cccDNA
相区分

(
见图
4 ,5)
。整合型

HBV DNA
在

DR2
区的

5′端也是一段完整的序列

,
但整合多发生在

112bp
的

DR
区
[6,7] , Wong D K
等
[6]
据此认为用入侵检查技术测到整合型

HBVDNA
的
几率应该很低。


图四

入侵检测技术原理示意图