第十九章 精液冷冻及精子库的管理-朱文兵

2021年2月19日发(作者：假性近视怎么恢复)

第十九章

精液冷冻及精子库的管理

中南大学生殖与干细胞工程研究所

中信湘雅生殖与遗传专科医院

朱文兵

第一节

精液冷冻

随着生殖工程技术的 兴起及发展，供精人工授精（
AID
）已经成为治疗某些不可恢复或
无法治疗的男性不 育症的重要疗法，
其中，
精液冷冻是其中的重要环节，
以下就精液冷冻的
原理 ，影响因素、相关步骤及临床应用进行叙述。

一

精液冷冻基本原理

在一定的低温条件下，以一定的时间作用于生物组织细胞，引起细 胞的降温、凝固、非
损伤性结冰，
使生物体内分子运动的速度减慢、
停止，
从 而使细胞代谢降低，
处于休眠状态，
达到贮存细胞的目的。细胞生活在细胞外液之中，
细胞膜将细胞内容物
（包括细胞内液）与
细胞外部环境分隔开来，
水分可以自由通过细 胞膜，
水分子从细胞内流向细胞外，
或是从细
胞外流向细胞内，主要取决于细胞内、外 液中溶质浓度差，即溶液渗透压的高低。
在细胞冷
冻过程中，
随着温度不断下降，细胞外液中，
作为各种电解质溶剂的水分首先形成细小的颗
粒状冰晶，
导致细胞外 水份减少，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，
使细胞内外液渗
透压失去平衡，
水 分将从渗透压低的内液通过细胞膜流向渗透压高的外液，
于是细胞自身脱
水皱缩。
用冷 冻过程中产生的渗透压的梯度使细胞皱缩，
而不损伤细胞
——
这就是细胞冷冻
贮存的基本原理。


由于冷冻降温速率的不同，
冰晶的形成会造成细胞的损 伤，
如快速冷冻时，
细胞冷冻太
快，细胞内液来不及脱水，形成冰晶，破坏细胞内的超 微结构称之为快速冷冻损伤；相反，
在慢速冷冻时，
细胞外液形成大量的冰晶，
细胞外 液渗透压突然升高，
在尚未降到低温贮存
温度前，
细胞可能会由于过份暴露在高浓度溶 质中或细胞严重脱水皱缩而死亡，
称之为慢速
冷冻损伤。

而冷冻保护剂由于 其高水溶性，可保证在冰晶形成过程中，仍停留在溶液中不被析出，
从而稀释细胞外液中溶质的浓度，< br>延缓细胞外液的过分减少及浓度增加的时间，
使得细胞顺
利通过临界温度阶段。


二

影响精液冷冻贮存的主要因素

影响人类精液冷冻贮 存的因素主要有：冷冻程序、冷冻保护剂、复苏速率、贮存方式，
及冷冻前精液质量等。

1.

冷冻程序

精子在冷冻过程中，
经过以下几个阶段，
根据不同阶段的损伤程度采用不同的冷冻速度
通过该阶段：①

温度休克阶段，室温～
5
℃

，此阶段细胞会遭受温度骤变造成的损 害，可
以
1
℃
/min
的速度通过该阶段；②

冰 晶潜热阶段，
5
～－
5
℃，该阶段中精浆形成冰晶，释
放热量，温度 升高，应快速通过该阶段；③

冰晶形成阶段，－
5
～－
15
℃；④

再结晶阶段 ，
－
15
～－
80
℃，
从－
5
～－
30
℃，
尤其是－
5
～－
15
℃为致死温度范围，细胞内 冰晶形成，
温
度骤变，往往会造成精子死亡，
应以
5
～
7< br>℃
/min
的速度通过该阶段。⑤

贮存阶段，
－
80
～
－
196
℃。

2.

冷冻保护剂


（
1
）具备的基本 条件：①对被冷冻的细胞无毒性；②具有高水溶性，保证在冰晶形成过程
中不被析出。

（
2
）种类：①渗入性冷冻保护剂：甘油、
DMSO
、丙二醇等；②细胞外 冷冻保护剂：蔗糖、
卵黄等




（
3
）常用冷冻保护剂配方：

将左侧的这些溶液依次置于烧瓶中， 搅拌均匀，
以
1mol/LNaHCO
3
调整
PH
值为7.2,
配制的保护
14ml
甘油（
AR
级）

剂总量为
100ml.
配好后放－
20
℃保存，使用期
















为
3
个月；
4
℃冰箱保存，使用期为
1
周。

26ml
5%
葡萄糖溶液

3.
复苏速率

冷冻过程中，
精子发生的一系列变化也会表现在
39ml
2.9%
枸橼酸鈉溶液

解冻时的反向顺序中，而快速复温（
100
℃
/min
左右）可避免精液在溶解前的再次形冰晶成，具
20ml
蛋黄

体步骤为：将贮存于液氮中的精液冷冻管取出，
1ml
1g/L
红霉素溶液

快速放入
3
7
℃的水浴箱中复温即可。

4.
贮存方式

现在人们多使用液氮来贮存精液，液氮是一种无色、无味的 气体，其沸点为－
195.8
℃。具
有低温、不助燃、不自燃、不易爆炸、来源丰富的 优点。其缺点为易蒸发、耗损量大，长期
贮存精子时，必需定期添加液氮以补充蒸发的损失。而且，液氮 气化后，体积会膨大
655
倍，因此盛放液氮的容器不能密封，以防放生爆炸。

5.
冷冻前精液质量

一般而言，
精液冷冻前的的活率及正常形态 率越高，
冷冻复苏后的精子活动率也越高，
同时，
由于个体差异的存在，不同人有不同 的冷冻效果。


三

精液冷冻步骤

1.
基本仪器设备及材料

程序冷冻仪、
超净工作台、
相差显微镜、水浴箱、
恒温培养箱、
冰箱、
酒精灯、
培养皿、
冷冻管、
1ml
注射器、冷冻保护剂

2.
人类精液快速冷冻步骤



（
1
）精液取出后，在
3
7
℃的水浴箱中液化；


（
2
）精液液化后按照
WHO
的标准进行常规分析，包 括精液量、颜色、气味、
PH
值、液化
状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好 相关记录；


（
3
）镜检时将冷冻保护剂复温至室温；

（
4
）将精液与冷冻保护剂按
1:1
的比例混匀，并分装于冷冻管中 ；

（
5
）冷冻管做好标记；

（
6
）将 冷冻管置入
4
℃冰箱
15min
；

（
7
）将冷冻管置入－
80
℃液氮蒸气中
15min
；

（
8
）将冷冻管投入液氮中冻存。

3.
人类精液程序冷冻步骤

前（
1
）
-
（
5
）步骤同快速冷冻一致。

（
6
）将冷冻管置于程序冷冻仪中，开始程序冷冻。冷冻程序如下

1
）
开始温度：
20
℃并平衡
5--10
分钟；< br>2
）
20
℃→
0
℃，
冷冻速率
-1
℃
/min
；
3
）
0
℃→
-30
℃，冷冻速率
-6
℃
/min
；
4
）
-30
℃→
-80
℃，冷冻速率
-30
℃
/min
（
7
）从程序冷冻仪中取出冷冻管，投入液氮中冻存

四

精液冷冻技术在人类辅助生殖技术中的应用

1.
应用于供精者精液的冻存，精液冻存是
AID
技术开展的重要基础。

2.
用于
IVF-ET
，对于排精困难的男性，可提前将精液冻存，便于医 患双方掌握治疗进展，
化学物质

用量