精子冷冻复苏效果的影响因素

2021年2月18日发(作者：小学生喝什么奶粉)
精子冷冻复苏效果的影响因素


【摘要】

不育症在世界 范围内的发生率为
l0
％～
15
％，其中约有一半因素来源于男方。流
行病学研究早已证实，
近
50
年以来，
男性精液的质量持续下降．
男性精子几乎减少了一半并
且每年还以
2.1
％的速度在减少。男性不育人数的增多甚 至出现精子危机。为了应对精子质
量的下滑，
保存技术显得尤为重要。
本文即对精子冷 冻复苏保存的影响因素进行探讨与总结。

【关键词】

精子；冷冻复苏；精浆；精子危机；储存



环顾四周，< br>男性不育人群日渐增加，
精子库也成为越来越多不育家庭求助的
借精之地。实际上，“精子危机”是否存在在学术界也有争论。
2013
年欧洲人类
生殖与胚胎学会伦 敦年会上关于男性的精子危机仍争论不一
[1]
。中华医学会男
科分会候任主任委员姜 辉说，
他所在的北京大学第三医院接诊的不育患者中，
无
精症男性比例从
20 04
年的
6%
上升到
2008
年的
10%
。
同时，
世界卫生组织颁布的
“精
子质量合格线”一直在下降，至
2010< br>年为
1500
万个，已是
30
年前的四分之一。为
了应对精子 质量的下降，
人类精子的冷冻保存则逐渐成为人类精子库及生殖中心
工作的重要组成部分。其用 途主要体现在：供精者精液保存、男性生育力保存、
男性不育症的治疗及最大限度降低传染性疾病的传播 。
因此，
精子冷冻复苏的效
果也越来越受到重视。

虽然我国人类精 子库的数量较多，
至
2011
年
12
月我国共批准建立了
1 5
家人类
精子库。
但需要的夫妇数量也很多，
至今仍存在供不应求的情况，< br>使得精子的储
存越来越受到重视。
影响精子冷冻复苏率的因素比较多，
主要分为 自身因素和非
自身因素。
本文通过查阅最近国内外文献，
将影响精子冷冻复苏效果的因 素分为
实验室因素（冷冻保护剂、冷冻方法、复苏方法等）
、精液自身因素（精浆因素、
精子因素）及其他因素（季节、禁欲时间）等并作如下综述：

1.
实验室因素对精子冷冻复苏效果的影响


近年来，
有大量文献研究如何提高人类精子的冷冻复苏率，
影响人精子冻贮

后效果的实验室因素主要有：冷冻保护剂、冷冻方法、精液与保护剂的比例、精
液处理后冷冻、 精液复苏方法、冻存时间等。


1.1
冷冻保护剂


研究表明，未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后，仅有
0.1%
的精

子具有一定程度的运动能力。
在精子冷冻之前，
为了减轻精子冷冻及复温过程中

细胞的损伤，
须加入一些具有保护作用的物质，
这些物质统称冷冻保护剂。
而精
子细胞里的活性氧（
ROS
）具有很强的氧化活性，其浓度过高可以诱导细胞的 脂
类、蛋白及细胞内的
DNA
氧化损伤，从而引起一系列的病理变化。有些不育男性< br>精液中缺乏与这些氧化物抗衡的物质，
从而引起不育。
有研究认为精浆中过多的
ROS
会导致精子的氧化损伤，以至于精子的功能受损以及精子核和精子
DNA
受损< br>[2]
。
因此，
ROS
导致人精子的损伤，
也可能降低精子对 冷冻复温的抵抗能力
[3]
。


有许多研究认为在冷冻保护 剂中添加一些抗氧化物质（如：维生素
E
、抗坏
血酸葡糖苷、谷光甘肽、抗坏血酸和过 氧化氢酶等）可以保护精子功能，明显提
高精子的冷冻复苏率。在冷冻保护剂中添加维生素
E< br>可以提高冷冻后精子的活动
力及精子
DNA
的完整性
[4
、< br>5]
；在冷冻保护剂中添加抗坏血酸等物质可以提高精
子冷冻复苏率，
LI等研究发现，
在精子冷冻保护剂中添加抗坏血酸和过氧化氢酶
可以抑制
ROS的活性，从而可以提高精子冷冻复苏率
[6]
。另外，添加谷胱甘肽
（
G SH
）
对精子冷冻损伤也有一定的保护作用
[7]
。
但也有研究认为 不添加保护剂
直接冻存和添加保护剂对精子
DNA
完整性的影响无显著差异
[ 8]
。

1.2
冷冻方法


根据降温速率不同将冷冻方法分为三种类型
:
快速冷冻法（液氮蒸汽法）
、
慢速冷冻法（程序冷冻法）和玻璃化冷冻法。目前，国内外许多研究认为采用快
速冷冻法和慢速 冷冻法两种方法冷冻后，
人类精子冷冻复苏率无统计学差异，
两
种方法冷冻方法均可适 用于常规的精子冷冻
[9
、
10
、
11
、
12]< br>。另外，通过玻璃
化冷冻方法对精子进行冷冻也取得很好的效果。
Isachenko V
等通过对上游法处
理好的精液，
用无冷冻保护剂与常规甘油保护剂的慢速冷冻方法比 较，
发现大体
积的玻璃化冷冻方法对精子复苏后精子活力、
精子膜完整性均高于普通的 冷冻方
法
[13]
。


冷冻过程中与冷冻保护剂接 触的时间和温度也会对精子冷冻复苏效果产生
影响。冷冻保护剂在温度较高的情况下随着温度上升，毒性 也随之增加。因此，
在精子冷冻前，一定要注意温度不要过高，室温应该保持在
20
～
30
℃。同时，要
注意平衡时间不宜太长。

1.3
复温方法

与精子冷冻过程一样，
复苏过程同样会对精子产生损伤。
但精子复苏过程到
目前为止，
还没有得到一个最佳的精液复苏方法。
一般认为水浴比在 空气中复温
速率更快，
并且外界温度越高，
复温速率越大。
现有的复温方法大 致包括
37
℃水
浴、
15
℃水浴、
冰水及室温空气中自然复 温
4
种。
有些研究认为
4
种复温方法效果
大致相同，
也有研究并不认同。
有研究认为冷冻精子在
40
℃条件下复苏比在
20℃
与
37
℃之间复苏有更高的精子冷冻复苏率，但两种温度复苏后精子的顶体完整
率、
DNA
一致性，
ATP
酶含量差异并没有统计学意义
[ 14]
。

1.4
精浆比例



人类的精浆成份比较复杂，
它的许多功能目前也没完全研究清楚。
有研究认

为精浆中的前列腺素
E
可以增加精子内的
cAMP
浓度
[1 5]
，以此来提高精子的运动

能力；此外，
Henricks
等认 为胰岛素样生长因子
I
及其在精子上的受体可以提高
精子运动能力，
尤其可以 提高直线运动速率
[16]
。
但也有研究认为精浆不利于精
子受精。
通常情况下，
在进行宫腔人工授精时，
精液常常洗涤以后使用以去除精
浆对受精的影响
[17]
。对于精浆，不同配比的保护剂，保护效力也会不同。有研
究显示，
与精浆浓度
50%
相比，
75%
精浆可能具有更好的保护效果
[18 ]
。
王学本等
通过对含精浆浓度为
0%,25%,50%,75%
和
100%
的精子冷冻复苏率进行比较得出结
论：
一定的精浆浓度可以提高精子 的冷冻复苏效果。
即对某些不育患者的异常精
液进行冷冻处理同时利用高冷冻复苏率的供者精浆 置换不育患者精液的精浆可
能获得较好的复苏效果
[19]
。

1.5
优选处理


正常的精子可以耐受一定范围内的冷冻 和解冻速率。
然而，
冷冻保存确实对
人精子功能有不良效应，
特别是降低精子 活力。
一般而言，
冷冻和解冻后仅约
50%
的活动精子存活。
优化冷 冻保存程序可使冷冻损伤降到最低，
并且可以由此增加
妊娠率
[20]
。并且 ，冷冻前精液质量越好（精子浓度、精子活力、形态正常精子
百分率）
，
冷冻复苏后精 子的活力就越高。
因此，
为了得到更高比例的活动精子，
常常会在冷冻前进行精子的优 选处理。这样的精子对冷冻复苏损伤的耐受性更
强，精子的冷冻复苏率更高。

1.6
反复冻融


这种影响主要表现在精子活力的影响。
人类精液 经过多次冷冻复苏过程，
仍
有一定比例的活动精子，
但是，
冷冻复温的循环次 数越多，
精子的活力和存活率
就会越低。
因此，
必须应该尽量减少这种冷冻复 苏的循环过程。
有研究认为每经
历一次冷冻复苏循环，精子
DNA
损伤率明显 增加，精子活动力及存活率明显下降
[21]
。

1.7
储存时限


从理论上讲，
保存在
-196
℃的精子细胞，
其代谢已基本停止，
目前较为一致

的观点是：
如果 储存的方式恰当，
在很长的一段时间内精子的存活率不会有很大

的变化，
可 以无限期地保存下去
[22]
。
众多的研究结果也表明，
精液在液氮中保存数日与数月乃至数年，复温后精子存活率相同
[23]
。
Yogev L 等对储存了
0.5-14.4
年的共
2525
份精液标本研究发现，长时间的精液保存不会影响复苏后前
向运动精子的浓度
[24]
。
但有些 研究也认为长期保存对精子会有一定程度的不利
影响
[25]
。

1.8
保存条件


用液氮蒸气代替液氮保存能够减少交叉 污染的机会。
因此有研究者建议将气
相技术用于艾滋病病毒、
乙肝病毒、
丙肝 病毒等携带者或患者的精子保存上。
然
而，在液氮气相贮存罐中，温度的梯度变化大，具体取决 于容器的形状、容量和
材料类型。
并且应用气相贮存，
需确保标本温度不低于
-130
℃否则易造成精子损
伤。
然而有研究关于精子在液氮及气态氮中保存对精子冻 存效果的影响进行了比
较，发现两种保存方式对冷冻精液的质量没有显著影响
[26]
。

2.
精液自身因素对冷冻复苏效果的影响

精子冷冻复苏率的 个体差异很大，
而且同一个人不同批次的精液其冷冻复苏
率也不尽相同。一般情况下，冷冻前精 子质量越高，解冻后精子的活力会越好，
因此精液常规参数可以作为预测精子冷冻复苏效果的重要指标。
精液的自身因素
包括：精子因素（精液常规参数、精子基因及蛋白）
、精浆成分（还原 型谷胱甘
肽含量、
ROS
浓度、胆固醇及
Ca
离子的浓度）等等。< br>
2.1
精子因素

2.1.1
精液常规参数

评估精液质量的常规参数主要包括精子浓度、
精子活力及形态正常精子百分
率等等。< br>使用冷冻前精液参数作为冷冻复苏后精子活力的预测指标的可靠性意见
仍不一致，
一些研 究表明，
冷冻前的精子活力与精子冷冻复苏率相关
[27]
；
另有
一 些研究表明使用冷冻前参数很难预测精子复苏率。
但大多数支持前者，
尤其是
精子正常 形态与冷冻复苏率具有更高的相关性。
Yogev L
等研究发现射精后
1h
及
4h
精子活动力是预测精子耐冻性最好的指标
[28]
。
此外，< br>形态异常的精子与正常
形态的精子相比，在经过冷冻后更容易引起
DNA
损伤< br>[29]
。

2.1.2
精子细胞凋亡


关于精子细胞的凋亡对冷冻复苏效果的影响，
Said
等对
10
例健 康志愿者的精
液通过磁性分离（
MACS
）技术进行处理，从而筛选到凋亡率低的精子 ，通过
MACS
技术筛选后的精子进行冷冻复苏后，
冷冻复苏率明显高于未经
MACS
技术筛选的精
子
,
因此，他们认为筛选过的细胞凋亡率低的精子更易 在冷冻复苏技术中保存更
久且获得更大的受精率。
[30]
。

2.1.3
精子的基因


人类精液冷冻技术在有些精液标本中应用得很成功，
但在有些精液标本中却

存在一些问题，
冷冻复苏后精子活力低。
现在，
有越来越多的证据表明精子对冷

冻复苏过程的耐受性存在着个体差异，
如：
有些人或者动物的精液在冷冻前各项< br>
参数都很好，
但冷冻复苏后精子的活力及存活率却很低。
而且无精症及弱精症 患
者的精子基因调研显示有基因异常。
因此寻找个体的基因差异能给精液冷冻保存
提供 基因基础指导。

2.1.4
精子的蛋白


热休 克蛋白
(HSP)
又称应激蛋白，是细胞应激反应的生物标志，也是细胞的
内源性保护 蛋白，发挥着分子伴侣的作用。研究发现，在精子冷冻复苏过程中，
精子受到有害因素的刺激，
HSP
将对精子的冷冻损伤有一定的保护作用。
HSP90
在公羊精子冷冻复苏过程中 ，就对精子冷冻损伤具有保护作用，
HSP90
含量也因
此可用于预测公羊精子的耐冻 能力
[31]
。

2.2
精浆因素

2.2.1
活性氧

精子获能及精子的顶体反应都需要活性氧（
ROS
）的存在，有研究表明缺乏